中枢神经系统病原宏基因组测序试剂技术审评要点（征求意见稿）（2026年最新版）

中枢神经系统病原宏基因组测序试剂技术审评要点（征求意见稿）

　　本审评要点旨在指导注册申请人对中枢神经系统病原宏基因组测序试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门提供参考。

　　本审评要点是对中枢神经系统病原宏基因组测序试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用。若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

一、适用范围

　　本审评要点适用于中枢神经系统病原宏基因组测序试剂注册申请和变更注册申请的情形，其他未尽事宜应当符合《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》(国家药品监督管理局公告2021年第122号)等相关法规要求。鉴于宏基因组方法临床应用效果未得到大规模验证，因此本文仅讨论宏基因组方法用于脑脊液样本中DNA检测的内容。

　　由于此类产品的生信分析流程与数据库定期更新与优化，在产品申报时应明确代表性病原体的种类，并且采用定型的产品进行非临床研究及临床试验。特别应注意的是，应在体外诊断试剂产品定型后(数据库和阳性判断值等)再开展临床试验。

二、注册审查要点

　　(一)监管信息

　　1.产品名称及分类编码

　　产品名称应符合《体外诊断试剂注册与备案管理办法》(国家市场监督管理总局令第48号)及相关法规的要求，如中枢神经系统病原宏基因组测序试剂盒(联合探针锚定测序法)。根据《体外诊断试剂分类规则》，该产品按照第三类体外诊断试剂管理，分类编码为6840。

　　2.其他信息还包括产品列表、关联文件、申报前与监管机构的联系情况和沟通记录以及符合性声明等文件。

　　(二)综述资料

　　综述资料主要包括概述、产品描述、预期用途、申报产品上市历史及其他需说明的内容。应详细说明产品所采用的技术原理及检测流程。提供代表性病原体确定的主要原则，建议包括：1.具有临床使用价值，在临床广泛应用、备受临床关注的病原体;2.具有系统生物学的代表性，覆盖病毒、细菌、真菌和寄生虫等主要系统大类;3.具有技术验证的代表性，技术层面较难检测的病原体;4.具有可及性，在临床上发生频率相对较高的病原体。基于以上原则，建议基于脑脊液样本的中枢神经系统感染的代表性病原体检测范围包括但不限于：

　　(1)病毒：建议至少包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6型、人类细小病毒B19、EB病毒和人疱疹病毒7型。

　　(2)细菌：建议至少包括大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增生李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、布鲁氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、结核分枝杆菌和肺炎克雷伯菌。

　　(3)真菌：建议至少包括新型隐球菌、格特隐球菌、白色念珠菌、热带念珠菌和烟曲霉菌。

　　(4)寄生虫：建议至少包括广州管圆线虫、猪带绦虫、弓形虫、阿米巴或血吸虫五种寄生虫中的四种。

　　(5)非典型病原体：建议至少包括一种非典型病原体，可纳入梅毒螺旋体或钩端螺旋体等。

　　建议该类产品的预期用途限定为：用于体外定性检测疑似中枢神经系统感染患者脑脊液样本中的DNA病原体，用于中枢神经系统感染的辅助诊断，用于提供补充病原学证据以进行辅助诊断。

　　适用人群主要包括：常规检测手段无法确认病原体的中枢神经系统感染疑似患者、以及重症和危急重症患者。

　　(三)产品技术要求及检验报告

　　注册申请人应当在原材料质量和生产工艺稳定的前提下，根据产品研制、前期评价等结果，依据国家标准、行业标准及有关文献资料，结合产品特性按照《医疗器械产品技术要求编写指导原则》(2022年第8号)的要求编写。该类产品作为第三类体外诊断试剂，应当以附录形式明确主要原材料以及生产工艺要求。

　　中枢神经系统病原宏基因组测序试剂如有国家标准品，技术要求中应体现国家标准品的相关要求，并使用国家标准品对三批产品进行检验。

　　如有适用的国家标准、行业标准，产品技术要求的相关要求应不低于相应的要求。

　　分析性能研究

　　在分析性能研究开展前，需对mNGS的全流程检测方法进行选择和固定，并实施对全流程体系变化的有效控制。包括但不限于：样本核酸提取方法、是否有非特异性扩增步骤、是否去宿主核酸以及去宿主核酸方法、建库方法、测序方法、适用仪器、配套试剂和耗材的生产厂家和货号、软件(版本号，含生物信息分析算法和数据库)。

　　申请人应采用在符合质量管理体系的环境下生产的试剂盒进行所有分析性能研究，提交具体研究方法、试验方案、试验数据、统计分析等详细资料。研究资料应明确以下信息，包括但不限于DNA提取浓度、文库浓度、下机有效数据量和总数据量、Q30等。

　　如申报产品适用不同的机型，需要提交采用不同机型进行性能评估的资料。如申报产品包含不同的包装规格，需要对各包装规格进行分析或验证。

　　分析性能评估用阳性样本应来源于病原体培养物或临床样本;如使用稀释样本，应采用可充分模拟适用样本类型的阴性基质。对于各项性能中采用的样本，在下述各项性能研究资料中分别提供样本信息列表。分析性能评估所用样本的基本信息均需明确，例如样本来源、样本类型、采集和处理方式、稀释方式、定值过程及数据等。如果样本的阴阳性或浓度值由其他单位提供，需要由该单位出具盖章的样本信息文件。

　　对于性能评估用的所有样本，均应采用性能经验证确认的方法对含有病原体的种类和浓度水平进行确认，包括但不限于已上市PCR检测试剂、测序、数字PCR、GM试验、病原体特异性抗体或抗原的血清学试验等。

　　建议着重对以下分析性能进行研究。

　　1.反应体系

　　1.1 湿试验检测流程的研究

　　包括对待测样本进行前处理、核酸提取、文库构建、高通量测序，以获得核酸测序数据的实验室操作环节，具体如下。

　　样本采集、运输和接收方法的研究：明确样本采集方式、保存条件、运输条件和样本送达实验室后至检测前的保存条件，建议引用样本采集和保存的SOP。说明控制污染的具体措施，提供相应的验证资料，并在产品说明书的样本要求中明确。

　　样本前处理方法及核酸释放和纯化方法的研究：对于每类病原体，分别评价并比较不同的前处理方法及核酸释放和纯化方法对于产品性能的影响，以保证产品能够实现检测厚壁的真菌以及胞内寄生菌。其中包括对于病原体或其核酸的核酸释放方法(物理研磨、化学裂解、酶消化等)、核酸纯化方法(磁珠法或柱法)的研究及样本去除宿主基因组方法的研究。

　　在进行核酸检测之前，建议有核酸提取/纯化步骤。该步骤的目的除最大量分离出目的DNA外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。需对各类病原体的核酸提取性能分别进行验证;包括核酸提取效率，提取后核酸浓度、纯度、精密度和抗干扰能力等研究及功能性试验。 若产品适用两种或以上核酸提取试剂，则每一种核酸提取试剂均需配合检测试剂进行抗干扰、精密度和检出限的验证。

　　文库构建及测序方法的研究：对临床样本用量、各试剂用量、建库反应条件(核酸投入量的下限和上限，标签、接头的连接质量等)、测序反应条件(包括测序读长以及单双端测序、检测数据量等)进行研究。明确文库质控要求及检测方法，应根据企业研究数据自行制定合理的质量控制指标，如文库片段大小以及测序读长、文库浓度、下机有效数据量和总数据量、Q30等参数。另外，建议对建库方法(TA连接法建库或转座酶建库等)、微生物是否需要进行片段化处理以及微生物占总数据量的比例进行研究。

　　不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述，并提交研究资料。

　　1.2 干实验流程的研究

　　是指对测序数据进行生物信息学分析及结果报告的过程，包括原始数据的存储与传输、数据预处理、过滤宿主序列、物种注释和参考数据库。应明确所使用的软件及数据库的版本。

　　详述生物信息分析的流程，每一个环节或软件模块的具体功能和质控参数。包括原始数据输入、标签识别、序列拆分、低质量和低复杂度序列过滤、去除宿主序列、去除接头、与参考数据库比对进行病原体注释以及过滤背景微生物的具体方法和验证结果，以及与阳性判断值的比对。每个步骤的流程均应经过选择、验证和确认，对每个步骤的关键参数进行详细的研究，以确保数据的准确性和完整性。mNGS检测到的病原体读数值受测序量、标本质量等因素的影响，并且同张芯片不同文库分配的下机数据量会有波动，所以有必要对读数值进行归一化处理。建议将每百万测序读长中匹配到某一病原体基因组的特异读数值 (RPM) 作为归一化指标。

　　1.3实验室标准操作规程

　　建议各个实验室为宏基因组测序产品建立一套标准化的标准操作规程以及管理要求，确保实验室操作的规范化、安全性及检测结果的质量。具体可参考《宏基因组高通量测序技术临床实验室规范化应用指南》。

　　2.样本稳定性

　　对采集后各阶段的样本进行稳定性研究，包括不同保存液、裂解液，不同灭活方式处理后的样本，研究内容包括冷藏保存时间，冷冻保存时间，冻融次数等。

　　如样本核酸提取后可不立即进行检测，还需对文库的保存条件和稳定性进行研究。

　　3.适用的样本类型

　　列明产品适用的样本类型。

　　4.精密度

　　应对精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。应考虑不同研究地点、日内/日间、操作者间、产品批次间以及不同仪器间等影响精密度的因素，设计合理的精密度试验方案，采用涵盖全部代表性病原体的菌株、毒株或血清型的不同排列组合的样本进行评价。

　　精密度评价试验应包含核酸提取步骤。设定合理的精密度评价周期，例如为期至少20天的检测。对检测数据进行统计分析(如方差分析方法)，获得重复性、实验室内精密度、实验室间精密度、批间精密度等结果。

　　应至少包含3个水平：阴性样本、临界阳性样本、中/强阳性样本。申请人应根据产品特性设定适当的精密度要求，并使用客观证据和有效的统计方法来验证这些指标设定标准。

　　5.分析特异性

　　5.1交叉反应

　　通过生物信息学识别具有序列同源性的病原体，至少应当包括人基因组和数据库中包含的病原体。应通过试验确认上述生物信息学分析所识别的病原体的交叉反应性。

　　样本验证：交叉反应研究样本除特殊说明外，应采用灭活的临床样本或添加了灭活病原体培养物的阴性临床样本，样本基质应可充分模拟适用样本类型的阴性基质，交叉反应研究用病原体种类主要考虑与报告病原体相邻种系的病原体(包括相同种属不同类型的病原体)以及经生信分析识别的可能存在交叉反应风险的病原体。极其罕见的病原体可采用假病毒进行交叉反应研究。

注：

病毒培养液的浓度单位可采用TCID50或PFU/mL，细菌培养物浓度单位可采用CFU/mL，建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。建议申请人参考相关文献等确定各种病原体感染的医学相关水平，一般为中强阳性浓度水平的病原体。

　　申请人应提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别信息和浓度确认等试验资料。

　　5.2干扰研究

　　5.2.1干扰试验

　　应根据所采集样本类型，针对可能存在的内源/外源物质干扰情况进行验证，验证推荐物质见表1。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度(“最差条件”)条件下进行试验，检测包含临界阳性水平在内的代表性病原体样本。对结果进行合理的统计分析，对比添加干扰物质前后的检测结果差异。检测的潜在干扰物包括脑脊液样本中的原有物质及在样本采集、处理和检测期时可能引入的物质。

　　表1 用于干扰试验的物质

类别	具体物质
样本中内源物质	乳酸、白细胞、免疫球蛋白
其他内源物质	人全血和高浓度人类基因组 DNA、人源cfDNA
样本采集、处理和检测期时可能引入的物质	转运培养基、消毒剂
	其他已知的物质
抗生素	左氧氟沙星、头孢曲松、美罗培南
解热镇痛药物	对乙酰氨基酚、阿司匹林
抗病毒药物	伐昔洛韦、更昔洛韦
抗真菌药物	氟胞嘧啶、伏立康唑、氟康唑

　　5.2.2建议进行交叉污染的研究。可采用强阳性样本和阴性样本交叉放置的模式，至少连续检测5轮次。如阴性样本结果均为阴性，说明无样本间交叉污染。强阳性样本中应包含至少2种高浓度病原体(推荐常见的细菌、病毒)，可使用病原体培养物。强阳性样本和阴性样本数量取决于仪器的通量，推荐阴阳性样本数量分别为仪器通量的一半。

　　6.检出限

　　6.1检出限的确定

　　每种病原体应进行充分的检出限研究。每一种病原体可使用至少3个不同来源的样本(如不同患者或者不同菌株、毒株)，梯度稀释于与可充分模拟适用样本类型的基质中，进行检出限的确定。每个浓度梯度最少重复3次检测，以100%可检出的最低浓度水平作为估计检出限，在此浓度附近制备若干梯度浓度样本，每个浓度至少重复20次检测，将具有95%阳性检出率的最低浓度水平作为确定的检出限。

　　6.2检出限的验证

　　选择另外2个不同来源的样本在检出限浓度水平进行验证，应达到95%阳性检出率。

　　应对各个代表性病原体分别进行研究。如使用患者样本研究，检出限可以拷贝数表示;如使用菌株、毒株研究，细菌和真菌的检出限以CFU或细胞数表示，病毒的检出限以感染单位(如PFU)表示。同时明确宿主细胞或宿主DNA浓度，对不同浓度宿主含量条件下的检出限进行研究：包括将临床可见最高浓度宿主细胞或者宿主来源的DNA作为基质成分，对不同浓度病原体核酸进行检出限的确定和验证。

　　7.包容性

　　7.1应当采用生物信息学分析方法对产品检测的包容性进行研究，应当覆盖已公布的代表性病原体的主要亚型。

　　7.2每个代表性病原体，验证具有时间和区域特征性的5至10个不同来源的阳性样本，所选样本需能够代表病原体相关的种属或亚种。研究应包括检出限和重复性的验证，注意包容性研究样本和检出限研究样本不能重复。

　　常见寄生虫需采用临床样本研究，另外可以对少见的寄生虫进行生物信息学分析以预测其反应性。

　　8.企业参考品验证

　　根据主要原材料研究资料中的企业参考品设置情况，采用三批产品对企业参考品进行检验并提供详细的试验数据。

　　9.其他分析性能

　　描述结果分析数据库的存储方式以及生信分析平台的要求，包括计算机与服务器、软件和生信分析人员的要求。

　　需明确数据库的建立筛选标准、明确参考序列的组成、数量、种类及数据质量。明确如何对致病病原体、背景微生物等不同类型的病原体进行注释。结果分析数据库包括病原体鉴定数据库、人源基因序列数据库和背景微生物数据库。说明数据库更新的程序，验证影响关键性能的参数及对于各个系统大类的代表性病原体检测的准确度，确保更新后的数据库的性能不低于更新前。非必要不更新配套数据库，如涉及试剂盒预期用途中代表性病原体序列更新等情况，需要进行产品变更注册。产品说明书应载明数据库完整版本号。

　　(五)稳定性研究

　　申报试剂的稳定性主要包括实时稳定性(有效期)、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括具体的实施方案、详细的研究数据以及统计分析结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批产品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

　　(六)阳性判断值研究

　　阳性判断值一般为申报产品检测代表性病原体核酸阳性的数值，用于区分定性检测的阴阳性结果。结果量值单位可为病原体特异性读数值(reads数)、标准化的每百万测序读数值中匹配到特定病原体的读数值(reads per million，RPM)、覆盖到参考基因组上非重叠区域的读数值或者每百万读数比值(RPM-r值)，即临床样本中特定病原体的序列数相对于阴性/空白对照中该病原体序列数的比值等。另外需明确结果的判读方式，包括根据阳性判断值判定病原体定性检测结果及排除外源因素引入的背景微生物。建议采用多个指标作为阳性判断值的辅助判断参数，主要包括：物种的属内排序、基因组覆盖度和均一度、阴阳性质控、同批次其他标本检出情况以及环境背景微生物基线。在阳性判断值确定过程中，需充分考虑不同实验室背景微生物的情况，通过生信分析流程和质量体系实施相应的控制措施。

　　对于各个代表性病原体，建议分别进行阳性判断值建立和验证，研究用样本来源应具有多样性和代表性，应充分覆盖各个代表性病原体的亚种、基因型或血清型，尽量纳入较多弱阳性水平样本、阴性样本和高人源背景的样本。对于每个代表性病原体，可采用ROC曲线分析法或者其他权威文献报道的合理方法按病原体种分别建立阳性判断值。对于特殊病原菌(如结核分枝杆菌、布鲁氏菌等胞内菌，隐球菌等厚壁菌)，需要建立单独的cut-off值和判读标准。每种代表性病原体需分别验证阳性判断值。

　　提交阳性判断值研究所用样本的背景信息列表，至少包括性别、年龄、唯一编号、样本来源机构、分子生物学检测结果等信息。分子生物学检测结果应来源于性能经验证确认的方法，如实时荧光PCR、一代测序、tNGS或数字PCR 方法等，并提交该方法的性能研究资料。

　　(七)其他非临床研究资料

　　1.主要原材料研究

　　该类产品的主要原材料包括PCR引物、标签接头、酶、PCR反应液、核酸分离/纯化组分(如有)、质控品、企业参考品等。应提供主要原材料的选择与来源、制备过程、质量控制标准等相关研究资料、质控品的定值试验资料等。如主要原材料为企业自制，应提供其详细制备过程;如主要原材料源于外购，应提供资料包括：选择该原材料的依据及对比筛选试验资料、供货方提供的质量标准、出厂检验报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。供应商应固定，不得随意更换。

　　PCR引物、标签接头：原材料选择的研究还应评价标签接头对于混合文库的拆分能力。需明确PCR引物和标签接头的序列信息。

　　酶：包括DNA聚合酶、多聚核苷酸磷酸激酶、Taq酶、连接酶、末端修复酶。

　　其他：包括Klenow片段、磁珠等。

　　1.2阴性对照和阳性对照、内参和样本标签

　　试剂盒一般包含阴性对照和阳性对照。阳性对照可采用含有人源核酸和典型病原体核酸，或含有人源细胞和灭活病原体的样本，建议根据病原体基因组大小、有无细胞壁、是否胞内菌及其它病原体特性分别纳入典型病原体核酸片段。可采用假病毒或质粒制备混合病原体核酸序列，病原体浓度应为弱阳性。阴性对照可采用包含一定浓度人基因组DNA且未掺入病原体的样本。

　　对照品需参与样本处理、核酸的平行提取和检测的全过程，以对整个样本处理、核酸提取纯化、文库构建及测序过程可能引入的试剂/设备、人员环境、样本污染等环节进行合理质量控制。阳性对照用于监测对阳性病原体(特别是弱阳性)的检测能力。阴性对照用来监测mNGS试剂(核酸提取、建库和测序试剂等)、环境、耗材引入微生物或气溶胶污染以及交叉污染。

　　提交试剂盒对照品有关原料选择、制备、定值过程、浓度范围等试验资料，并明确阴性、阳性对照的在控和失控标准。

　　试剂盒还包括内参和样本标签。内参用于监测每个样本检测过程的有效性，需与人源序列、样本中存在的病原体无交叉干扰，并应建立内参结果合格的判定标准。样本标签用于区分样本并监测样本间交叉污染。

　　建议限定配合使用的其他需要未提供的试剂和耗材(提取试剂等)的生产厂家和货号。

　　1.3企业参考品制备

　　申请人应根据产品性能验证的实际情况自行设定企业内部参考品，包括阳性参考品、阴性参考品、检出限参考品、精密度参考品。应提交企业参考品的原料来源、选择、制备、阴阳性及浓度确认方法或试剂等相关验证资料。

　　阳性参考品应包括代表性病原体的主要亚型，且应设置包含弱阳性在内的不同病原体浓度及高人源背景浓度。

　　阴性参考品则主要涉及对分析特异性(交叉反应)的验证情况，建议包括各个代表性病原体的近缘病原体等。

　　检出限参考品应包含各个代表性病原体95%阳性检出水平或略高于检出限的水平，至少应设置高人源背景浓度。

　　精密度参考品应根据病原体基因组大小、有无细胞壁、是否胞内菌及其它病原体特性分别设置。包括高、低两个浓度的样本，其中一个浓度应为检出限附近的浓度。

　　如果涉及将病原体DNA提取后打断制备企业参考品，还应对打断后核酸片段的长度进行研究，以证明可以充分模拟临床样本中的病原体游离DNA。另外明确企业参考品的人源核酸背景基质并合理设置参考品中的人源细胞浓度 (如105cells/ml)。如为模拟基质，需说明的制备方法和组成情况，并提交能够充分模拟真实样本的证据。

　　2.生产工艺研究资料

　　介绍产品主要生产工艺，可用流程图结合文字的方式表述。提交主要生产工艺的确定及优化研究资料。

　　生产企业应实施对于不同批次试剂背景微生物的控制措施，明确检测放行标准，并对每批次试剂均进行背景微生物(或其核酸片段)的确认，并附背景微生物列表。

　　(八)临床试验

　　该类产品的临床试验应至少包括如下3部分：

　　1.同一临床样本集在不同临床试验机构间的一致性研究

　　鉴于该类试剂的检测结果受实验环境和质量控制水平的影响较大，临床试验中还应采用同一临床试验样本集确认试验体外诊断试剂在不同临床试验机构间检测结果的一致性，该部分临床试验要求如下。

　　1.1 临床试验机构

　　该部分试验应在至少3家进行样本检测的临床试验机构开展，严格按照试验体外诊断试剂的产品说明书进行试验。

　　1.2 临床试验适用人群和样本集

　　1.2.1临床试验适用人群

　　应入组各种疑似中枢神经系统感染的患者，采集其脑脊液样本进行临床试验。

　　1.2.2临床试验样本集

　　临床试验样本集应来自开展本次临床试验的机构，至少包括6种病原体，覆盖病毒、细菌、真菌、寄生虫和非典型病原体不同病原体大类，同时纳入技术层面检测难度较高的病原体，每种病原体至少纳入3例。

　　1.3 其他

　　各临床试验机构根据临床试验进展开展样本集的检测，建议每家临床试验机构完成样本集检测后，再将样本集转运至下一家机构，保证每家临床试验机构的研究者均能对样本集中的所有样本根据产品说明书的要求进行检测和结果判读，最终各机构的数据形成该部分研究的数据集，用于后续统计分析。

　　应在临床试验方案和小结中明确该部分试验的具体情况，包括样本来源、试验方法和结果统计等，确保设计科学、流程规范和结果可追溯。

　　2.与其他分子生物学方法的比较研究

　　2.1 对比方法的选择

　　临床试验中应采用适宜的分子生物学方法作为对比方法进行比较研究，包括但不限于已上市病原体核酸检测试剂或自建的经充分评价的病原体核酸检测方法，如：实时荧光PCR方法、一代测序、NGS或数字PCR 方法等，以确认试验体外诊断试剂的临床检测性能。

　　如对比方法为自建检测方法，应提供其详细的建立与性能验证资料，并从检测原理、靶标区域、阳性判断值和最低检测限等方面，充分论证对比方法与试验体外诊断试剂的异同，确认二者具有良好的可比性，临床试验机构应牵头建立并对自建检测方法的真实性和科学性负责，并签章确认。如采用对比试剂，也应确认对比试剂的可比性。如自建检测方法涉及委托，还应提供临床试验机构与被委托方的委托协议。

　　2.2 临床试验机构

　　应选择至少3家经备案的医疗器械临床试验机构开展临床试验。临床试验机构应具有宏基因组方法学检测的技术优势，试验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节，熟悉评价方案。在整个临床试验过程中，试验体外诊断试剂和对比方法均应处于有效的质量控制下，以最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。各临床试验机构应建立相关管理制度，明确各方职责，加强培训和管理，确保临床试验结果真实、准确、完整和可追溯。

　　为保证入组受试者代表性和临床试验的可操作性，如临床试验参与机构较多，可选择其中部分机构开展检测试验，其他机构则仅负责入组受试者并采集样本。开展检测的临床试验机构应不少于3家，且上述机构的样本量应相对均衡。

　　如涉及样本转运，应在方案中明确各方职责和任务分工，如受试者入组、知情同意签署、样本采集、样本转运、样本检测、数据记录、数据传输以及数据统计分析等，并经各临床试验机构伦理委员会审查批准。

　　如涉及样本转运，应由开展样本检测的临床试验机构完成临床样本的检测、数据记录和数据传输，应由负责收样的临床试验机构完成受试者入组、样本采集、样本转运和本中心数据的统计分析。所有临床试验机构应分别完成各自的临床试验小结。

　　2.3 临床试验适用人群、样本和代表性病原体

　　2.3.1临床试验适用人群和样本

　　应入组各种疑似中枢神经系统感染的患者，包括常规检测手段无法确认病原体的中枢神经系统感染疑似患者、以及重症和危急重症患者，采集其脑脊液样本进行临床试验。

　　临床试验可前瞻性或回顾性入组受试者，不可使用人工制备的样本。临床试验用样本的采集和保存应符合相应说明书的要求。

　　2.3.2临床试验代表性病原体

　　为最大程度验证该类产品对适用范围内的所有病原体的检测能力，临床试验中需验证的病原体范围应具有充分的代表性。代表性病原体的选择应遵循以下原则：一是具有临床检测价值，临床常见且重点关注的病原体;二是具有系统生物学代表性，覆盖病毒、细菌、真菌、寄生虫或非典型病原体等主要病原微生物大类;三是具有技术验证的代表性，涵盖技术层面检测难度较高的病原体;四是具有临床可及性，为临床发生频率相对较高的病原体。基于以上原则，建议基于脑脊液样本的中枢神经系统感染的代表性病原体检测范围包括但不限于：

　　(1)病毒：建议至少包括巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6型、人类细小病毒B19、EB病毒和人疱疹病毒7型。

　　(2)细菌：建议至少包括大肠埃希菌、流感嗜血杆菌、单核细胞增生李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、布鲁氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、结核分枝杆菌和肺炎克雷伯菌。

　　(3)真菌：建议至少包括新型隐球菌、格特隐球菌、白色念珠菌、热带念珠菌和烟曲霉菌。

　　(4)寄生虫：建议至少包括广州管圆线虫、猪带绦虫、弓形虫、阿米巴或血吸虫五种寄生虫中的四种。

　　(5)非典型病原体：建议至少包括一种非典型病原体，可纳入梅毒螺旋体或钩端螺旋体等。

　　2.4 临床试验样本量

　　(1)总阳性和总阴性样本量

　　临床试验建议采用单组目标值法分别估算总阳性和总阴性样本的例数，同时考虑脱落情况，估算最低样本总量。阳性符合率和阴性符合率的目标值(临床可接受的最低标准)建议均不低于90%。

　　(2)每大类病原体(病毒、细菌、真菌、寄生虫和非典型病原体)的阳性样本量

　　针对病毒、细菌和真菌，每大类病原体的阳性样本量可采用抽样精度的公式进行估算。针对寄生虫和非典型病原体，每大类病原体应至少纳入20例阳性样本。

　　同时，每大类病原体中拟验证的每种病原体均有一定阳性例数。

　　3.与临床参考标准的比较研究

　　3.1 临床参考标准

　　除上述与分子生物学方法的比对研究外，还应开展试验体外诊断试剂与临床参考标准的比对研究。

　　临床参考标准包括但不限于病原微生物培养鉴定、涂片镜检、抗原检测(如：隐球菌)或临床综合诊断等，建议优先采用病原学方法(如：培养鉴定)作为临床参考标准，应详细说明临床参考标准的确定依据。

　　试验体外诊断试剂与临床参考标准的检测结果应为同期检测的结果，后者的检测结果可来自同步开展的临床试验，也可来自临床诊疗过程中的诊断结果。

　　3.2 临床试验机构

　　该部分临床试验要求同2.2临床试验机构要求。

　　3.3 临床试验适用人群和样本

　　该部分临床试验要求同2.3.1临床试验适用人群和样本要求。

　　3.4临床试验样本量

　　原则上，纳入“2.与其他分子生物学方法的比较研究”中的每个病例均应有临床参考标准的结果，因此，该部分临床试验的样本量同“2.4 临床试验样本量(1)总阳性和总阴性样本量”的要求。

　　4.统计分析

　　试验体外诊断试剂的检测结果应为根据试验体外诊断试剂产品说明书的阳性判断值得到的各病原体的阴阳性判定结果，以此结果进行定性统计分析。

　　针对与对比方法/临床参考标准的定性统计分析，一般以2×2表的形式基于每种病原体、每大类病原体和所有病原体，分别对结果进行总结，并据此计算阳性符合率/临床灵敏度、阴性符合率/临床特异度、总符合率及其95%置信区间。如临床试验中涉及样本转运，针对经过转运的样本，还应进行分层统计分析，以确认样本转运未对临床试验结果产生影响。针对与临床参考标准的比较分析，还应基于不同的临床参考标准(病原学方法或非病原学方法)，进行试验体外诊断试剂与临床参考标准的分层统计分析。

　　针对同一样本集在不同机构间一致性研究的定性统计分析，建议将各家机构的检测结果进行两两一致性比对分析。

　　在统计分析中，对于检测结果不一致的样本，可采用合理方法进行复核，并结合临床诊断和实验室检测结果等对差异原因进行充分分析。

　　5.其他

　　5.1 有关临床试验中背景微生物的要求

　　各临床试验机构应提供背景微生物的控制过程，明确各临床试验机构实验室的背景微生物情况，同时，在临床试验小结和报告中明确数据分析中背景微生物的应用和控制情况。

　　5.2 有关临床试验中实验室管理要求

　　各临床试验机构应严格按照《医疗器械临床试验质量管理规范》的相关要求进行临床试验，同时，基于该类产品的特点，申请人还应根据试验体外诊断试剂产品检测过程中可能存在的风险，在产品说明书中明确实验室管理要求，包括人员、病原体污染控制和室内/室间质量控制要求等。

　　针对开展样本检测的临床试验机构，应对照试验体外诊断试剂产品说明书中确定的实验室管理要求，确认开展样本检测的临床试验机构是否满足上述要求，并提供相关支持性资料，该部分资料应由临床试验机构出具并签章确认。

　　产品说明书和标签样稿

　　产品说明书格式应满足《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求。产品说明书中技术内容应与注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，应以规范格式进行标注，并单独列明文献的相关信息。应重点关注以下内容。

　　【预期用途】

　　本产品用于体外定性检测疑似中枢神经系统感染患者脑脊液样本中的DNA病原体，用于中枢神经系统感染的辅助诊断，用于提供补充病原学证据以进行辅助诊断。

　　适用人群主要包括：常规检测手段无法确认病原体的中枢神经系统感染疑似患者、以及重症和危急重症患者。本产品检测结果不作为患者临床诊断、治疗或其他管理决策的唯一依据，仅供临床参考。阴性结果不能排除中枢神经系统感染，阳性结果不能排除检测指标外其他病原体混合感染情况。

　　以下代表性病原体经过系统的验证和确认：

　　2.【检验原理】

　　简述产品的核酸提取和扩增原理，检测的代表性病原体目标基因序列特征。简要描述防污染措施。

　　3.【主要组成成分】

　　明确试剂盒中各组分及具体成分。明确需要但未提供的材料，例如核酸提取试剂，通用测序试剂等的产品名称，生产厂家，货号及注册证号、备案号等信息。

　　4.【样本要求】

　　需详细描述样本采集、分离和质量控制方式，描述样本的保存稳定性。

　　5.【检验方法】

　　明确核酸提取用的样本体积、文库浓度与上样量等，阴、阳性对照与待测样本同步进行核酸提取操作。明确各适用机型的反应参数设置。明确试验有效性的质控标准。

　　6.【检验结果的解释】

　　6.1列明判读规则以及结果阴性、阳性、复测、无效等所有情形。

　　6.2对于结果报告中的全部微生物，建议临床使用单位结合临床信息以及背景数据库对其潜在的临床意义进行注释。

　　6.3针对代表性验证病原体之外检出的病原体，应在报告中进行注释，仅作为临床检测的提示，不作为临床诊断的病原学证据，明确该部分检测未经过验证，应结合其他方法学进行确认。

　　7.【检验方法的局限性】

　　7.1本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

　　7.2 本技术无法区分检出核酸来源于活菌、死亡裂解病原体核酸残留、既往感染遗留核酸;无法区分微生物属于致病感染、人体定植、一过性感染、样本采集带入、实验室环境污染。条件致病菌检出，需结合宿主免疫状态、样本类型、临床症状评估临床意义。

　　7.3有关假阳性结果的可能性分析，阳性结果不能直接等同于临床感染。

　　7.4受样本质量、核酸提取效率、宿主核酸占比、测序深度、参考基因组数据库覆盖度影响，可出现病原体漏检;阴性结果不能排除感染。

　　7.5序列数、相对丰度、RPM值仅为参考参数，不能单独用于判定致病性。

　　7.6受参考基因组数据库完整性影响，数据库未收录的病原体、变异株、未知新发病原可发生漏检;高占比人源宿主核酸、样本核酸降解、病原体核酸含量过低、破壁提取效率不足，均可造成假阴性，阴性结果不能完全排除感染性疾病。

　　7.7宏基因组测序结果的解读应结合临床症状、体征、其他检查结果及病原体特性等综合进行判定。

　　7.8 不合理的样本采集、运输、储存及处理过程均有可能影响检测结果。

　　8.【产品性能指标】

　　简述以下性能指标：

　　8.1国家标准品(如有)和企业参考品的符合率。

　　8.2检出限：简要介绍评价方法、所用样本情况以及评价结果。

　　8.3对包容性的研究情况进行总结。

　　8.4对精密度的研究情况进行总结。

　　8.5分析特异性

　　8.5.1交叉反应：详述交叉反应验证的病原体种类，及有/无交叉反应的浓度水平。

　　8.5.2干扰试验：说明验证的干扰物质种类及有/无干扰反应的浓度水平。

　　8.6临床试验：简要介绍试验方法、受试者及样本、试验结果和结论等。

　　9.【注意事项】

　　9.1 实验室应用要求

　　本试剂盒应在符合《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》的实验室开展相关检测，并符合《宏基因组高通量测序技术临床实验室规范化应用指南(2026版)》要求。

　　9.2 生物安全要求

　　本试剂检测样本应视为具有传染性物质，操作和处理均应符合《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》相关要求。

　　9.3其他