CMDE：《结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂注册审查指导原则（2026年修订版）（征求意见稿）》！

结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂注册审查指导原则（2026年修订版）（征求意见稿）

　　本指导原则旨在指导注册申请人对结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

　　本指导原则是针对结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需阐述具体理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

　　本指导原则是对注册申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，也不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

　　本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

一、范围

　　本指导原则所述结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂是指：利用分子生物学技术，对结核病患者的临床样本或临床培养物样本中的结核分枝杆菌复合群耐药基因突变进行体外定性检测的试剂。

　　针对该类产品的设计，需关注如下几点：

　　1. 鉴于结核分枝杆菌复合群不同耐药基因与表型的符合率有较大差异，建议申请人选择公认符合率较高的抗生素耐药基因作为靶标。如同一种抗生素存在多个耐药基因或耐药突变位点，建议申请人在产品设计时考虑申报产品对耐药基因/突变位点的覆盖率。

　　2. 该类产品在设计上主要包括两种形式，一种仅检测结核分枝杆菌复合群耐药基因突变(简称：单功能试剂)，另一种同时检测结核分枝杆菌复合群核酸及耐药基因突变(简称：双功能试剂)。针对双功能试剂，核酸检测适用于《结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂注册审查指导原则(2025年修订版)》，耐药基因突变检测部分适用于本指导原则。

　　针对单功能试剂，预期用途可表述为以下三种类型：

　　1.申报产品的检验原理可区分具体突变类型，结果报告具体突变类型(a类)。建议表述为：本产品用于体外定性检测结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性的xx样本中yy耐药基因突变，可检测的突变位点包括zz，本产品可区分具体突变位点。其中，mm基因突变与nn药物耐药相关。

　　2.已知申报产品可检测的具体突变位点(如：针对具体突变位点设计特异突变探针，从检验原理上已知可检测哪些突变位点)，但结果不区分具体突变位点，结果报告为耐药/敏感等(b类)。建议表述为：本产品用于体外定性检测结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性的xx样本中yy耐药基因突变，可检测的突变位点包括zz，本产品不区分具体突变位点。其中，mm基因突变与nn药物耐药相关。

　　3.某段核酸区域内任一位点的突变均可导致对某种药物耐药，申报产品从检验原理上没有必要明确区分具体突变位点，结果报告为耐药/敏感(c类)。建议表述为：本产品用于体外定性检测结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性的xx样本中yy耐药基因突变，本产品无法明确具体突变位点。其中，mm基因突变与nn药物耐药相关。

　　针对双功能试剂，预期用途可表述为：

　　1.针对a类试剂：本产品用于体外定性检测xx样本中的结核分枝杆菌复合群核酸及yy耐药基因突变，可检测的突变位点包括zz，本产品可区分具体突变位点。其中，mm基因突变与nn药物耐药相关。

　　2.针对b类试剂：本产品用于体外定性检测xx样本中的结核分枝杆菌复合群核酸及yy耐药基因突变，可检测的突变位点包括zz，本产品不区分具体突变位点。其中，mm基因突变与nn药物耐药相关。

　　3.针对c类试剂：本产品用于体外定性检测xx样本中的结核分枝杆菌复合群核酸及yy耐药基因突变，本产品无法明确具体突变位点。其中，mm基因突变与nn药物耐药相关。

　　本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法确立的，对于线性杂交、基因芯片或测序等其他核酸检测技术，可能部分要求不完全适用或本指导原则所述技术指标不够全面，注册申请人可根据产品特性选择合适的方法进行评价和验证，并验证其科学合理性，同时确认性能评价的充分性。本指导原则适用于进行产品注册申报和变更注册的情形。本指导原则针对结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂注册申报资料中的部分内容进行撰写，其他未尽事宜应当符合《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》等相关法规要求。

二、注册申报资料要求

　　(一)监管信息

　　1.产品名称及分类编码

　　产品名称应符合《体外诊断试剂注册与备案管理办法》及相关法规的要求，如结核分枝杆菌利福平耐药基因检测试剂盒(荧光PCR法)根据《体外诊断试剂分类目录》，与致病性病原体抗原、抗体以及核酸等检测相关的试剂管理类别为Ⅲ类，分类编码为6840。

　　2.其他信息

　　还包括产品列表、关联文件、申报前与监管机构的联系情况和沟通记录以及符合性声明等文件。

　　(二)综述资料

　　综述资料主要包括概述、产品描述、预期用途、申报产品上市历史及其他需说明的内容等。应详述申报产品采用的技术原理与检测流程，着重从样本类型、检测靶标及突变类型、检测原理、方法学、产品组成、判读规则、反应体系、分析性能及临床性能等方面详述申报产品与已获批上市的同类产品之间的异同。提交靶标及突变类型选择的详实充分的科学证据，包括：基因位置、突变区域的选择、突变类型与结核分枝杆菌复合群表型耐药的相关性以及突变检测的临床意义等，证明申报产品的检测靶标具有明确的临床意义。

　　(三)非临床资料

　　1.产品技术要求及检验报告

　　注册申请人应当在原材料质量和生产工艺稳定的前提下，根据产品研制、前期评价等结果，依据国家标准、行业标准及有关文献资料，结合产品特性按照《医疗器械产品技术要求编写指导原则》的要求编写。该类产品作为第三类体外诊断试剂，应当以附录形式明确主要原材料以及生产工艺要求。

　　该类试剂的产品检验主要包括以下性能指标：物理性状、阴/阳性参考品符合率、精密度和最低检测限等。

　　如有适用的国家标准品，技术要求中应体现国家标准品的相关要求，并使用国家标准品对三批产品进行检验。目前，已公布结核分枝杆菌利福平耐药基因检测试剂用国家参考品、结核分枝杆菌异烟肼耐药基因检测试剂用国家参考品，如申报产品适用，应当使用国家参考品进行检验。如申报产品设计的基因突变位点部分未包含在相应的国家参考品中，用国家参考品检验的同时，还需采用企业参考品中包含该基因突变位点的样本进行检验。

　　如后续有适用的国家标准、行业标准，产品技术要求的相关要求建议不低于相应的要求。

　　2. 分析性能研究

　　注册申请人应采用在符合质量管理体系的环境下生产的试剂盒进行所有分析性能研究，提交具体研究方法、试验方案、试验数据、统计分析等详细资料。如申报产品适用不同的机型，需要提交采用不同机型进行性能评估的资料。如申报产品包含不同的包装规格，需要对各包装规格进行分析或验证。

　　分析性能评估所用样本的基本信息均需明确，如样本来源、样本类型、耐药突变基因型、样本采集、处理方式、制备方法、稀释方式、定值过程及数据等。应采用科学合理的方法确定研究用样本的耐药基因型和浓度水平，并提交具体的试验资料。

　　采用适宜方法进行菌株浓度的确认，可采用铺板计数细菌集落形成单位(colony forming unit，CFU)的方法进行菌株浓度的确认，以CFU/mL作为菌株浓度的表示方式;如产品适用于国家参考品，也可采用相应的国家参考品对菌株浓度进行标定，以“个菌/mL”作为菌株浓度的表示方式。

　　对于适用的不同样本类型应分别进行分析性能研究。研究用样本一般应为临床样本或菌株。如采用菌株进行研究，需采用与适用样本类型一致的阴性基质。

　　2.1.样本稳定性

　　对采集后各阶段的样本进行稳定性研究，包括采集后未经处理的样本、加入不同处理液的样本，研究内容包括常温保存时间、冷藏保存时间，冷冻保存时间，冻融次数等。

　　如产品适用痰、支气管肺泡灌洗液等不同的样本类型，应对每种样本类型均进行稳定性研究。用于样本稳定性研究的样本应包括略高于检出限浓度的样本，覆盖检测范围内每种突变基因各至少1-2种常见/代表性突变类型。

　　如核酸提取液可不立即进行检测，还需对核酸提取液的保存条件和稳定性进行研究。

　　2.2适用的样本类型

　　列明产品适用的样本类型。

　　2.3准确度

　　采用申报试剂与临床诊断方法或已上市产品，同时检测临床样本/菌株，比较检测结果之间的一致性程度，进行申报试剂的准确度评价。

　　研究用样本应均为结核分支杆菌复合群核酸阳性样本，耐药基因阳性和耐药基因阴性样本均包含一定数量，耐药基因阳性样本涵盖所有可检测的突变类型，确定难以获得的突变类型在提供充足证据的情况下可采用核酸样本(基因组DNA)。此外还应包含阳性判断值附近的样本和干扰样本。

　　2.4企业参考品验证

　　根据主要原材料研究资料中的企业参考品设置情况，采用三批产品对企业参考品进行检验并提供详细的试验数据。

　　2.5精密度

　　应对精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。应考虑运行、时间、操作者、仪器、试剂批次和地点等影响精密度的条件，设计合理的精密度试验方案进行评价。精密度评价试验应包含核酸提取步骤。设定合理的精密度评价周期，例如为期至少20天的检测，具体方案可参考性能评价相关文件进行。

　　应覆盖检测范围内所有不同耐药突变基因的常见/代表性突变类型。同时，如产品设计包括不同的反应管及检测通道，各反应管及检测通道均需有代表性样本。建议在以下3个浓度进行验证：

　　阴性样本：靶序列未发生突变的结核分枝杆菌野生型菌株，阴性检出率应为100%(n≥20)。

　　弱阳性样本：耐药菌株浓度略高于申报产品的最低检测限，阳性检出率应高于95%(n≥20)。

　　中等阳性样本：阳性检出率为100%且CV≤15%(n≥20)。

　　2.6最低检测限

　　扩增反应终体系中的突变序列百分率和总核酸浓度两个因素对最低检测限的影响较大，终体系中突变序列的百分率越高、所含的DNA量越多，则越容易检出。而终体系中的这两个因素是由临床样本中的结核分枝杆菌耐药菌与野生菌的含量和相对比例决定的。因此，最低检测限研究时需从以下两个方面进行考察：

　　2.6.1 100%耐药比例下耐药菌株的最低检测浓度，该部分研究包括最低检测限的建立与验证。

　　(1)最低检测限的建立

　　将结核分枝杆菌耐药菌株梯度稀释于与适用样本一致的阴性基质中，每个浓度梯度至少重复20次检测，通过直接检测或者Probit分析计算，将具有95%阳性检出率的耐药菌株最低浓度水平作为确定的检出限。应包括产品设计检测范围内所有常见突变类型。以CFU/mL或“个菌/mL”作为菌株浓度的表示方式。此外，申请人还应采用数字PCR等方法进行菌株核酸浓度的确认，以copies/mL作为菌株浓度的表示方式。

　　(2)最低检测限的验证

　　选择与最低检测限不同来源的结核分枝杆菌耐药菌株在最低检测限浓度水平进行验证，应达到95%阳性检出率。应覆盖产品所有设计可检测的突变类型。对于确定难以获得的菌株，可在提交相应的支持说明资料的前提下使用含有相应突变的核酸样本(基因组DNA)进行研究。

　　2.6.2不同耐药比例下的最低检测限验证，该部分研究仅进行最低检测限的验证。

　　固定耐药菌株为最低检测限水平，将野生菌株加入到耐药菌株中进行混合，通过调整加入的野生菌株的含量，制备出含不同耐药比例的菌株混合样本，验证申报产品在2.6.1部分确定的最低检测限在不同耐药比例下能否稳定检出。应包括产品设计检测范围内的常见突变类型。

　　验证时耐药菌株比例建议包括90%、75%、50%、25%、20%、10%，可视情况调整验证的比例水平。建议按耐药比例降序依次进行验证，确定能稳定检出的耐药菌株比例下限。验证方式及要求可参照前述内容。无论验证情况如何，申请人均应将不同耐药比例下最低检测限的验证情况体现在产品说明书中。

　　2.7分析特异性

　　2.7.1交叉反应

　　2.7.1.1野生型验证：采用高浓度野生型结核分枝杆菌进行验证，结果应为敏感或阴性。

　　2.7.1.2申报产品声称的全部突变类型间的交叉反应验证。

　　2.7.1.3对申报产品检测范围外的其他常见突变类型适当进行交叉反应验证。

　　2.7.1.4对于痰等临床样本类型，鉴于可检测样本中可能同时含有结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌复合群，为了验证非结核分枝杆菌复合群等其他病原体对申报产品的检测结果是否造成假阴性和假阳性结果，需对核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他病原体进行交叉反应的验证。通常，进行交叉反应验证的分枝杆菌、细菌或真菌感染的浓度水平为106CFU/mL或更高，病毒为105PFU/mL或更高。

　　用于交叉反应研究的其他分枝杆菌具体包括：堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、土地分枝杆菌、次要分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、苏加分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胃分枝杆菌、胞内分枝杆菌、草分枝杆菌、亚洲分枝杆菌。上述细菌均应进行验证。

　　用于交叉反应研究的其他病原体具体包括：肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、隐球菌、金黄色葡萄球菌、诺卡氏菌、绿脓杆菌、白色念珠菌、人流感病毒(A型和B型)、人类副流感病毒(1、2和3型)。上述病原体均应进行验证。

　　2.7.2干扰研究

　　2.7.2.1内源/外源物质干扰

　　潜在干扰物质主要包括：内源性物质(不含待检野生/突变靶标的相应临床样本、血红蛋白、黏液蛋白等)和外源性干扰物质(如常见治疗药物等)。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度(最差条件)条件下进行评价。对于常见药物干扰试验，建议参照相应药物药代动力学研究确定的治疗药物浓度添加相应药物进行干扰验证。

　　用于干扰研究的外源性药物具体包括：抗结核药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、贝达喹啉、利奈唑胺、普托马尼、莫西沙星等)抗生素(如：阿莫西林、左氧氟沙星)、鼻腔喷雾剂或滴鼻剂(如：肾上腺素、羟甲唑啉、含防腐剂的氯化钠溶液)、鼻用软膏类(如：莫匹罗星)、抗病毒药(如：扎那米韦)、鼻腔糖皮质激素(如：倍氯米松、地塞米松、氟尼缩松、曲安西龙、布地奈德、莫美他松、氟替卡松)。上述外源性药物均应进行验证，括号内至少选做一种。

　　对于培养物样本，干扰物质主要为适用培养基和相关药物(如孔雀石绿、两性霉素B、多黏菌素B、万古霉素等)的干扰，应在最低检测限浓度及阴性条件下验证相关药物和培养基对检测结果的影响，明确不产生干扰的最大培养基药物浓度。

　　2.7.2.2竞争性干扰

　　临床上存在多种耐药基因突变的情况，应考虑评价高浓度分析物对低浓度分析物检测的影响。竞争性干扰建议考虑常见不同耐药突变类型混合存在的情形，考察高浓度/高突变比例类型对低浓度/低突变类型检测的影响。

　　2.8不同样本前处理方法和核酸提取纯化方法的分析性能资料要求

　　如果某种样本类型可采用几种方法进行样本前处理，申请人应提交适用的样本前处理方法(进行全项目分析性能评估的样本前处理方法除外)与后续试验配合进行的性能试验(至少包括最低检测限和精密度项目)，以证明不同的样本前处理方法不影响检测结果。

　　如果某种样本类型可采用几种方法进行核酸提取纯化，应对配合使用的所有核酸提取试剂进行核酸提取纯度、浓度、提取效率的研究，与公认的性能较好的核酸提取试剂进行比对。申请人应提供适用的核酸提取纯化方法(进行全项目分析性能评估的核酸提取纯化方法除外)与后续试验配合进行的性能试验(至少包括最低检测限和精密度项目)，以证明不同的核酸提取纯化方法不影响检测结果。

　　2.9反应体系

　　2.9.1样本采集和处理

　　应进行样本采集方式的研究。明确样本采集时间点的选择及是否受病程、临床症状、用药情况等因素的影响。

　　样本处理方式的选择：应对样本前处理方式进行研究。如痰样本应对痰消化方式及消化液成分、使用量进行研究。如产品适用两种或以上消化液，则每一种消化液均需配合提取试剂及检测试剂进行精密度和检出限的验证。

　　2.9.2核酸提取和反应体系

　　研究确定最佳核酸提取和反应体系，包括核酸提取用的样本体积、洗脱体积和PCR加样体积、各种酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度及反应各阶段温度、时间、循环数等。建议在保证核酸提取质量的情况下尽量扩大总反应体系和加样量，以提高检测灵敏度。

　　不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述，并提交验证资料。

　　3.稳定性研究资料

　　稳定性研究资料主要包括实时稳定性(有效期)、使用稳定性(如开瓶稳定性、复溶稳定性、冻融稳定性)等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。稳定性研究具体可参照《体外诊断试剂稳定性研究注册审查指导原则》。

　　4.阳性判断值确定资料

　　对于此类试剂，阳性判断值确定资料主要是指申报产品检测结核分支杆菌复合群耐药基因突变阳性的Ct值/Ct值的差值/荧光信号差值/Tm值/Tm值差值等。阳性判断值研究用样本来源应具有多样性和代表性，考虑不同地区、不同的感染阶段和生理状态等因素，纳入多例弱阳性样本。样本应覆盖申报产品可检测的所有突变类型(确定难以获取的可采用基因组DNA样本)。建议采用受试者工作特征(ROC)曲线的方式建立阳性判断值。如采用其他方式，应说明合理性。如存在灰区，应提交灰区上下限确定的依据及详细研究资料。

　　如果产品适用不同样本类型，不同的样本类型应分别进行阳性判断值的研究。

　　提交阳性判断值研究所用样本的背景信息列表，至少包括性别、年龄、临床诊断信息、样本来源机构、检测结果等信息。

　　提供内标检测结果范围的确定方法和研究资料。

　　5.其他资料

　　5.1主要原材料研究资料

　　该类产品的主要原材料包括引物、探针、酶、dNTP、核酸分离/纯化组分(如有)、对照品(质控品)、企业参考品等。应提供主要原材料的选择与来源、制备过程、质量分析和质控标准等相关研究资料。若主要原材料为企业自制，其生产工艺须稳定，并提交详细的制备过程研究资料/主要原材料的生产工艺验证报告;如主要原材料源于外购，应提交选择该原材料的依据及对比筛选试验资料、生产商提供的质量标准、出厂检验报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。生产商应固定，不得随意更换。

　　5.1.1引物和探针：应详述引物和探针的设计原则及依据，提供引物、探针核酸序列、靶序列的选择依据及对应情况。建议每种检测靶标设计两套或多套引物、探针以供筛选。通过筛选确定最佳的引物和探针组合，并提交详细的筛选研究数据。同时应针对引物、探针核酸序列及检测靶序列进行包容性与特异性评价，如有同源序列应着重评价是否会有交叉反应。引物、探针的质量标准应至少包括序列准确性、分子量、纯度、浓度及功能性试验等。

　　5.1.2脱氧三磷酸核苷(dNTP)：包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP;应提交对纯度、浓度以及功能性等的验证资料。

　　5.1.3酶

　　DNA聚合酶应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性，如：94℃保温1小时后仍保持50%活性;尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG/UNG)应具有水解尿嘧啶糖苷键的活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性。

　　应对酶活性、热稳定性、功能性等进行合理验证。

　　5.1.4核酸分离纯化组分(如有)：提交主要组成、原理介绍及相关的验证资料。

　　核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶(DNase)污染。

　　5.1.5对照品(质控品)

　　申报产品的质控体系通过设置各种对照来实现，以对样本核酸分离纯化、配液及加样、试剂及仪器性能、扩增反应抑制物(管内抑制)、交叉污染和靶核酸降解等因素可能造成的假阴性或假阳性结果进行合理质控。申报资料应详细说明各种对照的原料选择、制备和定值过程等。

　　本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法建立的，对于采用该方法学的结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂，建议至少设置阳性对照、内对照(内标)和阴性对照。

　　5.1.5.1阳性对照

　　阳性对照可对实验过程进行质控。阳性对照可采用菌株、质粒或基因组提取物等，应包含试剂盒检测的靶序列。企业应对阳性对照相应判断数值做出明确要求。

　　5.1.5.2内对照(内标)

　　内对照可对实验过程的假阴性结果进行质量控制，应与靶核酸一同提取及扩增。申请人应对内对照的引物、探针的设计和相关反应体系的浓度进行研究，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性又要尽量降低对靶核酸序列检测造成的抑制而导致假阴性。企业应对内对照或相应判断数值做出明确要求。建议科学设置内对照(内标)，对待测样本的取样质量、试剂的反应体系进行监控。

　　5.1.5.3阴性对照

　　阴性对照可采用含有野生型靶序列的核酸或空白对照，以对交叉污染造成的假阳性结果进行质控。阴性对照需参与样本核酸的平行提取纯化。

　　由于申报产品所适用的临床样本比较复杂，其中可能含有各种影响PCR反应的抑制物，造成假阴性。因此，申报产品应充分考虑对样本核酸提取纯化环节的质量控制，通过设置各种对照进行质控。比如，采用克隆菌株作为内对照或阳性对照并参与样本核酸的平行提取纯化，或者设置专门的核酸提取纯化对照(如菌株)等，以对样本核酸提取纯化的质量及效率进行评估。

　　5.1.6企业参考品：详细说明企业参考品的原料选择、制备和定值过程等试验资料。企业参考品可采用模拟临床样本基质，不建议直接采用临床样本(如痰液)。

　　5.1.6.1阳性参考品

　　应包括申报产品声称的全部突变类型。阳性参考品的突变类型需经过金标准方法、测序或已上市同类分型试剂的确认。阳性参考品应采用菌株，确定难以获得的可采用含突变的核酸(结核分枝杆菌基因组DNA)。

　　5.1.6.2阴性参考品

　　可采用经确认靶序列未发生突变的结核分枝杆菌菌株、申报产品声称的检测范围外的其他结核分枝杆菌突变类型的核酸等。

　　5.1.6.3最低检测限参考品

　　最低检测限参考品应为最低检测限水平，应含有声称的所有突变类型。应采用菌株，确定难以获得的可采用含突变的核酸(结核分枝杆菌基因组DNA)。

　　5.1.6.4精密度参考品

　　精密度参考品至少应包括弱阳性水平及中/强阳性水平，应采用菌株，包括申报产品检测范围内所有耐药突变基因各至少1-2种常见/代表性突变类型。同时，如产品设计包括不同的反应管及检测通道，各反应管及检测通道均需设置代表性精密度参考品。

　　对于c类预期用途的产品，应尽可能采用菌株对常见突变类型设置上述各种类型的企业参考品。对于利福平耐药基因突变检测试剂，阳性参考品、最低检测限参考品至少应包括4—5种常见突变类型。对于其他药物的耐药基因突变检测试剂，阳性参考品、最低检测限参考品至少应包括耐药相关的常见突变类型，突变类型的数量可根据申报产品的具体情况而定。精密度参考品要求同上，如产品设计包括不同的反应管及检测通道，各反应管及检测通道均需设置代表性精密度参考品。阴性参考品要求同上。

　　5.2生产工艺研究

　　应介绍产品的主要生产工艺，可用流程图结合文字的方式表述。并提交主要生产工艺的确定及优化的研究资料。

　　如申报产品包含核酸提取纯化试剂，应提交对核酸提取纯化过程进行工艺优化的研究资料。

　　(四)临床试验研究

　　1. 临床试验机构

　　申请人应当选定不少于3家(含3家)经备案的医疗器械临床试验机构，按照相关规定开展临床试验。申请人应根据产品特点及其预期用途，综合不同地区人种、流行病学背景和病原微生物的特性等因素选择临床试验机构。

　　2. 临床试验适用人群及样本

　　2.1对于单功能试剂，临床试验的适用人群为结核病患者，适用样本为结核分枝杆菌复合群阳性的样本。样本类型一般包括临床样本或临床培养物样本。

　　如为临床样本，结核分枝杆菌复合群阳性的确认方法一般为已获国家药监局批准上市的结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂或临床普遍认可的结核分枝杆菌复合群培养和鉴定方法(如：PNB、抗原、质谱或其他分子生物学方法等)，结核分枝杆菌复合群阳性结果可来自于临床诊疗过程。

　　如为临床培养物样本，结核分枝杆菌复合群阳性的确认方法一般为临床普遍认可的结核分枝杆菌复合群鉴定方法(如：PNB、抗原、质谱或其他分子生物学方法等)，结核分枝杆菌复合群阳性结果可来自于临床诊疗过程。

　　针对临床样本，需在申报产品说明书中明确结核分枝杆菌复合群阳性的确认方法为经国家局批准的结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂和/或临床普遍认可的培养鉴定方法;针对临床培养物样本，需在申报产品说明书中明确具体的培养方法，同时明确结核分枝杆菌复合群阳性的确认方法为临床普遍认可的鉴定方法。

　　临床试验中结核分枝杆菌复合群阳性样本的确认方法应符合申报产品说明书的要求。

　　2.2对于双功能试剂，临床试验的适用人群为疑似结核病患者，适用样本为疑似结核病患者的临床样本。

　　3.临床试验设计

　　3.1对于已有同类产品上市的申报产品

　　建议选择已上市同类产品作为对比试剂进行比较研究。对比试剂在预期用途、适用人群、样本类型、耐药基因及突变位点及检测性能等方面应与申报产品具有较好的可比性。

　　建议选择可区分耐药突变位点的产品作为对比试剂。如对比试剂无法区分耐药突变位点，还应针对对比试剂检测阳性的样本采用合适的方法(如：测序)确认具体突变位点和突变类型。

　　3.2 对于无同类产品上市的新产品

　　对于新的结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂，选择传统药敏试验方法和核酸测序测定作为对比方法。

　　针对传统药敏试验方法，临床试验中采用的抗结核药物应与申报产品说明书预期用途中明确的抗结核药物一致。所使用的抗结核药物建议明确到具体的药物名称而不是类。

　　4. 临床试验样本量

　　4.1针对与已上市同类产品或核酸序列测定方法的对比试验，可采用单组目标值法公式分别估算每个耐药基因的最低阳性和阴性样本例数。样本量估算公式如下，

　　公式中，n为样本量;Z1-α/2、Z1-β为显著性水平和把握度的标准正态分布的分数位，P0为评价指标的临床可接受标准，PT为申报产品评价指标预期值。

　　其中阳性符合率和阴性符合率的临床可接受标准(P0)建议不低于90%。临床试验结果中，相关评价指标的95%置信区间下限应不低于预设的临床可接受标准。当评价指标P接近100%时，上述样本量估算方法可能不适用，应考虑选择更加适宜的方法进行样本量估算和统计学分析，如精确概率法等。

　　临床试验应对申报产品声称的每种引物和/或探针进行充分验证。同时，针对a类产品和b类产品，申报产品检测范围内的每种突变位点均应具有一定的阳性例数;对于临床发生率低的突变位点，可结合申报产品的检测原理(如：是否共用相同的引物及探针等)及申报产品的整体检测性能等综合考虑。针对c类产品，应对常见突变位点进行充分验证，每种常见突变位点均应具有一定的阳性例数。

　　与已上市同类产品进行比较时，应纳入至少30例弱阳性样本。

　　4.2针对上述临床试验设计中(3.2和3.3)中申报产品与传统药敏试验的对比研究，可采用单组目标值法公式分别估算每种抗生素的最低耐药和敏感样本例数。其中灵敏度和特异度的临床可接受标准(P0)的设置应满足临床使用需求。

　　4.3鉴于痰、支气管肺泡灌洗液以及培养物等样本之间差异较大，如申报产品同时适用于上述几种样本类型，每种样本类型应分别进行统计学估算。如申报产品同时声称多种样本类型，弱阳性样本应覆盖每种样本类型。

　　4.4如申报产品针对某种样本类型同时适用于直接裂解核酸提取法和磁珠等核酸提取/纯化方法，建议采用直接裂解法进行主体临床试验，同时进行不少于100例不同核酸提取/纯化方法之间的比较研究(与申报产品的同源比对，或与已上市同类产品的比对)，证明不同核酸提取/纯化方法不影响检测结果，其中，阳性和阴性样本应各不少于50例。

　　4.5如申报产品针对某种样本类型同时适用于几种核酸提取/纯化方法(不包括直接裂解法)，且非临床分析性能研究显示几种核酸提取方法不存在差异，原则上临床试验中可选择一种提取/纯化方法;如申报产品针对某种样本类型同时适用于几种样本处理方法，且非临床分析性能研究显示几种样本处理方法不存在差异，原则上临床试验中可选择一种前处理方法。

　　4.6如申报产品适用于液体培养物和固体培养物样本类型，临床试验可将两种培养物进行汇总统计。

　　5. 临床试验数据汇总表及统计分析

　　5.1临床试验的数据汇总表应包括申报产品的结果、对比试剂/方法的结果、临床诊断(对于单功能试剂，明确为结核病)、临床诊断背景信息(对于双功能试剂，明确体征症状等证明其为疑似结核病患者)等。

　　5.2对于申报产品与对比试剂/方法的比较研究，选择交叉四格表形式总结二者的定性检测结果，并据此计算申报产品的灵敏度/特异度或阳性/阴性符合率及其95%置信区间。如涉及不同样本类型，应针对每种样本类型分别进行统计分析。

　　5.3结果差异样本的处理

　　对于检测结果不一致的样本，应采用合理方法进行复核，同时结合患者的临床病情等对差异原因及可能结果进行分析。

　　6. 临床资料的形式要求

　　申请人应按照《体外诊断试剂注册与备案管理办法》、《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》等法规文件要求提交各机构伦理审查意见、临床试验方案、临床试验小结、临床试验报告以及临床试验数据库。

　　(五)产品说明书

　　产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》最新修订版本的要求，境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书一致，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的其他注册申报资料保持一致，如某些内容引自参考文献，则应采用规范格式对此内容进行标注，并单独列明文献的相关信息。

　　下面对结核分枝杆菌复合群耐药基因突变检测试剂说明书的重点内容进行详细说明，以指导注册申报人员合理编制说明书。

　　1.【预期用途】

　　根据【检验结果的解释】的结果报告形式，【预期用途】第一段表述可参考前述【范围】中相关内容。

　　介绍与耐药相关的耐药基因及突变位点;明确申报产品可检测的突变位点或耐药核酸区域导致的表型耐药占临床所有表型耐药的比例。

　　2.【检验原理】

　　2.1对试剂盒检测靶标以及突变类型(如适用)进行详细描述(基因名称和基因位置、靶序列长度、突变类型(如适用)及相关特征等)，对试剂盒所用探针、引物、突变或耐药的判定终点等进行详细的介绍;对不同样品反应管组合、对照设置及荧光信号检测原理等进行介绍。

　　2.2试剂盒技术原理的详细介绍，建议结合适当图示进行说明。如反应体系中添加了相关的防污染组分(如UNG酶)，也应对其作用机理进行适当介绍。

　　3.【主要组成成分】

　　3.1说明试剂盒包含组分的名称、数量、比例或浓度等信息，说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。

　　3.2试剂盒中不包含但对该项检测必须的组份，企业应列出相关试剂/耗材的名称、货号及其他相关信息。

　　3.3如果试剂盒中不包含用于核酸提取纯化的试剂组份，则应在此注明经过验证后配合使用的商品化核酸提取纯化试剂盒的生产企业、产品名称以及产品货号和医疗器械备案号等详细信息。

　　4.【储存条件及有效期】

　　说明试剂盒的效期稳定性、开封稳定性、复溶稳定性、运输稳定性和冻融次数要求等，应明确具体的储存条件及有效期。

　　5.【样本要求】重点明确以下内容：

　　5.1临床样本的收集：建议参照《临床技术操作规范(结核病分册)》(中华医学会编著)或者《结核病诊断实验室检验规程》(中国防痨协会基础专业委员会编著)现行有效版本推荐的采样要求或国外的同类文件，并详细描述采样步骤和注意事项。

　　5.2临床样本的前处理：建议参考《临床技术操作规范(结核病分册)》(中华医学会编著)或者《结核病诊断实验室检验规程》(中国防痨协会基础专业委员会编著)现行有效版本推荐的前处理方法或国外的同类文件，详细描述具体的前处理方法。

　　5.3培养物样本：详细描述培养方法，包括：从患者采集的临床样本类型、样本采集后处理、所用培养基、相关药物和具体操作步骤等、申报产品从培养物中取样进行检测的时间点、取样方法和对培养物样本的处理等。

　　5.4样本的其他处理和保存：明确核酸提取纯化前的其他处理(如离心和洗涤等)、保存条件及期限(短期和长期)。冷藏/冷冻样本检测前是否需要恢复至室温，冻融次数的限制等。

　　5.5明确结核分枝杆菌复合群阳性的确认方法。

　　6.【适用仪器】说明适用的仪器及其型号，并提供与仪器有关的信息以便用户能够正确选择使用。

　　7.【检验方法】详细说明实验操作的各个步骤，包括：

　　7.1实验条件：实验室分区、实验环境的温度、湿度和空调气流方向控制等注意事项。

　　7.2试剂配制方法和注意事项。

　　7.3详述样本前处理方法，详述待测样本及相关对照品的核酸提取纯化的条件、步骤及注意事项(如适用)。

　　7.4扩增反应前准备：加样体积、顺序等。

　　7.5 PCR各阶段的温度、时间设置、循环数设置或相应的自动化检测程序及相关注意事项。

　　7.6仪器设置(如适用)：特殊参数、探针的荧光素标记情况、对待测突变及内对照(内标)和其他对照的荧光通道选择等。

　　8.【检验结果的解释】

　　结合阳性对照、阴性对照、内对照、核酸提取纯化对照(如适用)、样本管检测结果以及已验证的突变类型与耐药之间的关系，以列表的形式详述所有可能出现的结果及相应的解释。如存在检测灰区(如：耐药不确定等)，应详述对于灰区结果的处理方式。

　　9.【检验方法的局限性】

　　9.1申报产品仅对下述突变类型xx进行了验证。对于c类产品，在此处明确境内临床试验做过验证的突变类型。

　　9.2 申报产品的检测结果仅作为初筛结果，仅供临床参考，用于辅助诊断结核分枝杆菌复合群的耐药性，不应作为患者耐药的确诊依据。临床医生应结合患者病情、药物适应症、疗效及其他实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。

　　9.3本产品仅检测靶标区域内突变引起的耐药。由其他基因或基因区域的突变、以及其他耐药机制引起的耐药本产品不能检出。

　　9.4本产品不能用于监测患者对于抗生素的治疗进展以及成功与否，因为经过抗菌治疗后，细菌DNA可能仍旧存在。

　　9.5有关假阴性结果的可能性分析

　　9.5.1不合理的样本采集、运送及处理、样本中细菌含量过低、核酸过度降解或扩增反应体系中靶标浓度低于检测限均有可能导致假阴性结果。

　　9.5.2未经验证的其他干扰或PCR抑制因子等可能会导致假阴性结果(如有)。

　　10.【产品性能指标】简述以下性能指标：

　　10.1对国家参考品检测的符合情况，简要描述采用国家参考品进行检测的结果(如适用)。

　　10.2准确度。

　　10.3精密度：简单介绍精密度的确定方法，并明确精密度结果。

　　10.4最低检测限：简单介绍最低检测限的确定方法，并明确最低检测限结果。明确不同耐药比例最低检测限验证情况。

　　10.5分析特异性

　　10.5.1野生型验证：应采用不同浓度的野生型样本进行验证，结果应均为阴性。

　　10.5.2可检测突变之间的交叉反应：如申报产品可检测多种突变，还需验证申报产品声称的所有突变类型之间是否存在交叉反应。

　　10.5.3申报产品检测范围外的其他常见突变类型交叉反应验证情况。

　　10.5.4干扰物质验证：样本中常见干扰物质对检测结果的影响。

　　10.6临床试验：简要介绍试验方法、受试者及样本、试验结果和结论等。

　　11.【注意事项】应至少包括以下内容：

　　11.1本产品仅用于体外诊断。

　　11.2临床实验室应严格按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》等有关分子生物学实验室要求。

　　11.3试剂保存运输及使用过程中多种因素可能导致性能变化，如保存运输不当、样本采集、样本处理及检测过程操作不规范等，请严格按照说明书操作。因样本采集过程及细菌感染过程本身的特点，可能存在采集到的样本量不足等原因带来的假阴性结果，应结合临床其他诊疗信息综合判断，必要时复测。

　　11.4生物安全防护相关内容。

　　11.5避免实验室污染的措施。

三、参考文献

　　[1]国家市场监督管理总局.体外诊断试剂注册与备案管理办法:国家市场监督管理总局令第48号[Z].

　　[2]国家药品监督管理局.关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告:国家药品监督管理局公告2021年第122号[Z].

　　[3]国家药品监督管理局.体外诊断试剂临床试验技术指导原则:国家药品监督管理局2021年第72号[Z].

　　[4]国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心.定性检测体外诊断试剂分析性能评估注册审查指导原则:国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心2022年第36号[Z].

　　[5]国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心.体外诊断试剂说明书编写指导原则(2023年修订版):国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心2024年第1号[Z].

　　[6]中国防痨协会结核病控制专业分会，中国防痨协会标准化专业分会，中国防痨协会老年结核病防治专业分会. 结核分枝杆菌感染检测技术应用专家共识[J]:中国防痨杂志,2025,47(7)813-829.