肿瘤伴随诊断相关基因突变检测试剂（实时荧光聚合酶链反应法）注册审查指导原则（2025年修订版）

　　本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤伴随诊断相关基因突变检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

　　本指导原则是对肿瘤伴随诊断相关基因突变检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用。若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

　　本指导原则是供注册申请人和技术审评人员使用的指导性文件，但不包括审评审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究和验证资料。

　　本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，相关内容也将适时进行调整。

一、适用范围

　　本指导原则适用于基于实时荧光聚合酶链反应(Real time PCR)方法的核酸检测技术，以肿瘤伴随诊断相关的基因变异为检测目标，对人体样本(包括组织、体液等)提取的核酸组分中的目标序列进行体外检测的试剂。

　　本指导原则所指基因突变的类型包括置换、插入、缺失、融合基因、拷贝数异常及核糖核酸(RNA)表达异常等广义的基因突变，不包含肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性。

　　本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法确立的，对于高分辨熔解曲线PCR方法、核酸检测芯片、数字PCR等其他基于PCR的分子生物学检测技术，可能部分要求不完全适用或本指导原则所述技术指标不够全面，申请人可以根据实际产品特性选择适合的方法或补充需要的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证其科学合理性，同时确认性能评价的充分性。本指导原则所涉及试剂的方法学不包括荧光原位杂交(Fluorescence in situHybridization，FISH)、核酸序列测定(如不包括二代测序、焦磷酸测序等)等用于伴随诊断基因变异检测的其他方法学。

　　对于伴随诊断试剂，其与治疗药物具有关联性，申请人需结合突变基因检测与治疗药物预期用途所限定的癌症类型进行联合评价研究。

　　本指导原则适用于进行注册申报和变更注册的产品。本指导原则针对注册申报资料中的部分内容进行撰写，其他未尽事宜应当符合《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》等法规要求及其他伴随诊断相关指导原则要求。

二、注册审查要点

（一）监管信息

　　1.产品名称及分类编码

　　产品名称应符合《体外诊断试剂注册与备案管理办法》及相关法规的要求。按照《体外诊断试剂分类规则》，该产品为第三类体外诊断试剂，分类编码为6840。

　　2.申请人还需提交产品列表、关联文件、申报前与监管机构的联系情况和沟通记录及符合性声明等文件。

（二）综述资料

　　综述资料主要包括概述、产品描述、预期用途、申报产品上市历史及其他需说明的内容。其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学、不同基因突变类型检出能力及肿瘤个体化治疗药物、适用人群及临床意义等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。若尚无同品种批准上市，则应详细论述作为检测靶标的基因变异与肿瘤治疗药物的相关性，说明科学依据。

　　提交的资料应符合《体外诊断试剂注册与备案管理办法》(以下简称《办法》)和《体外诊断试剂注册申报资料要求及说明》的相关要求。

（三）非临床资料

　　1.产品技术要求及检验报告

　　按照《医疗器械产品技术要求编写指导原则》的要求编写产品技术要求，并提交三个不同批次符合产品技术要求的全项目检验报告。提交资料应符合《体外诊断试剂注册申报资料要求及说明》《医疗器械自检管理规定》等相关文件的要求。

　　2.分析性能研究

　　注册申请人应当在原材料和生产工艺经过选择和确认、质量管理体系得到有效控制并且保证产品质量稳定的基础上，采用完整、确定的检测系统进行分析性能评估。

　　对于每项分析性能的评价都应包括具体研究目的、研究方法、试验方案、试验数据、统计分析等详细资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点、采用的试剂名称、规格和批号，仪器名称和型号，样本类型和来源等。分析性能评估的试验方法可以参考国际或国内有关体外诊断试剂性能评估的指导原则进行。若试剂用于RNA样本检测，则在性能评估中(除非特别说明)需对所有突变位点均采用RNA样本，从而对逆转录过程进行验证。

　　如申报产品适用不同的机型，需要提交采用不同机型进行性能评估的资料。如申报产品包含不同的包装规格，需要对各包装规格进行分析或验证。

　　对于需要研究的变异位点，应全面评估声称可检测的变异类型及变异位点。对于可选择代表性位点的情形，应选择涵盖不同的反应单元、不同的反应体系、不同的引物探针覆盖序列以及常见或者重要的变异基因位点进行研究。对于野生型基因组DNA是指与被测基因变异位点对应的野生型基因组DNA。

　　建议着重对以下分析性能进行研究。

　　2.1样本稳定性

　　样本稳定性研究主要包括样本提取前核酸序列的稳定性和样本提取后核酸序列的稳定性两方面。申请人应建立样本核酸提取评价的具体要求。此外对于可冷冻样本，如适用，申请人应评价提取前、提取后冻融次数、储存条件等因素。在长时间储存后，应在使用前采用合理方法评价肿瘤组织/肿瘤细胞含量、核酸浓度、纯度、核酸完整性或降解程度。如果包括多种样本类型，则需分别完成相关研究。

　　2.1.1样本提取前核酸序列的稳定性

　　对于经福尔马林固定石蜡包埋组织切片样本，申请人应对组织样本保存温度，保存年限进行限定。建议明确组织切片样本的规范采集标准，验证不同时间段保存的组织样本对检测结果的影响。

　　对于新鲜冰冻切片样本，应限定新鲜冰冻切片样本检测时限，明确新鲜冰冻切片的切片要求。

　　对于外周血样本，外周血采集后，应对外周血存放条件、存放时限及温度设置等进行验证，包括采用抗核酸降解或防细胞裂解采血管的要求。采样所用的防腐剂、抗凝剂、保护剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。申请人还需对抗凝剂、防腐剂、保护剂等成分进行验证。申请人应对外周血样本保存时间及温度、离心参数设置等进行验证。

　　对于以循环游离DNA(cfDNA，cell free DNA)为检测物质的试剂，血浆和血清中cfDNA的检出率可能存在差异。在标本的采集、运输及储存过程中，防止游离DNA的降解是首要考虑的因素。其次，也应防止血液中白细胞的裂解，避免因野生型DNA的增加导致cfDNA中的基因变异无法检测。

　　2.1.2样本提取后核酸序列的稳定性

　　对于组织样本，应检测核酸的含量，设置反应体系需要的核酸含量上限和下限。设置反应体系所需初始DNA含量范围，如单位体积DNA浓度超过所需浓度上限或下限，应提供相应的改进措施。对于外周血样本，应检测核酸的含量，设置反应体系所需初始DNA含量范围，如单位体积DNA浓度低于所需浓度，应提供相应的改进措施。同时，应对核酸提取物的保存时间，保存温度进行验证。并评价冻融次数、储存条件等对样本提取后核酸序列稳定性的影响。此外应采用合理方法对样本提取后核酸序列评价其纯度。

　　2.1.3样本完整性

　　在样本提取前、提取过程、提取后以及在储存期间，核酸会发生不同程度地降解。为使降解降低到最低程度(提取前或提取后)，应避免样品的多次冷冻/融化。必要时，申请人应评价提取前、提取后冻融次数、储存条件等因素。在长时间储存后，应在使用前评价核酸的完整性。比较检测结果与储存前检测结果的一致性，如采用琼脂糖凝胶电泳或者内参基因PCR检测等方法。

　　2.2适用的样本类型

　　明确适用的样本类型。病理组织切片需明确组织、肿瘤等信息。

　　如果试剂适用于多种样本类型，应采用合理方法评价每种样本类型及添加剂的适用性。对具有可比性的样本类型，可选择具有统计学意义数量的样本进行样本一致性的同源比对研究;对于不具有可比性的样本类型，应对每种样本类型分别进行分析性能评估。如若试剂盒适用的样本类型既包含石蜡包埋组织切片亦包含冷冻组织切片或血液样本等，则需对所有样本类型的适用性进行评估，并提交评估资料。对于来源不同部位的相同样本类型的样本，应根据预期用途、产品特性等进行充分评价。

　　如果样本的采集、处理方式存在差别，例如适用不同采样器、不同样本保存液、不同处理方法(如核酸的提取与纯化、组织切片处理等)，应分析这些差别的潜在影响，并进行针对性的分析性能验证。对于检测外周血cfDNA的试剂，应明确配套使用的采血管的要求。采样所用的防腐剂、抗凝剂、保护剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰。申请人还需对抗凝剂、防腐剂、保护剂等成分进行验证。

　　申请人应结合配套的核酸提取试剂以及检出限性能研究，对满足性能要求的最低肿瘤组织占比/肿瘤细胞比例进行研究，需明确肿瘤细胞组成、数量的确定方法。例如，对于病理组织学样本类型，如福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)，对肿瘤组织占比进行研究，确定满足性能指标要求的最少肿瘤组织比例。

　　2.3准确度

　　申请人可采用以下两种方法之一对基因变异的检出能力进行准确度研究。一种方法是方法学比对，采用申报试剂与标准方法(或参考方法)或同类已上市产品，同时检测同一批临床样本，比较检测结果之间的一致性程度;另一种方法是通过检测参考品/参考盘分析申报产品检测结果与经确认结果的符合情况，评价申报产品的准确度。

　　应采用一定数量临床样本验证该类产品的检测准确性，并提供样本例数的确定依据，根据检测位点多少，采用相应数量的临床阳性样本进行研究。样本类型与说明书声称的样本类型一致，应包含所有突变类型及突变位点。同时建议考察对复合突变样本/人工构建质粒的检出能力。

　　提供所有试验用样本来源、基因突变、型别确认等试验资料。

　　2.4企业参考品检验

　　根据主要原材料研究资料中的企业参考品设置情况，采用至少三批产品对企业参考品进行检验并提供详细的试验数据。

　　2.5精密度

　　应对精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。应考虑运行、时间、操作者、仪器、试剂批次和地点等影响精密度的条件，设计合理的精密度试验方案进行评价。精密度评价试验应包含核酸提取/纯化等样本处理步骤。设定合理的精密度评价周期，例如为期至少20天的检测。对检测数据进行统计分析，获得重复性、实验室内精密度、实验室间精密度、批间精密度等结果。具体方案可参考性能评价相关文件进行。精密度评价应尽量采用临床样本进行试验，对于难以获取的浓度，可采用不同浓度的样本及阴性样本进行混合，对于特定难以获取的突变类型，可适当采用人工制备的样本。试验操作完全按照说明书执行，包含核酸提取/纯化等样本处理步骤。

　　用于精密度评价的样本应考虑肿瘤伴随诊断相关基因的常见变异位点及所有变异类型的临床样本，并应包含每一反应单元易错或代表性的样本。应阐述研究位点选择依据，明确样本的来源、浓度和性质确定方法。设置至少低浓度和中/高浓度两个水平，并分别至少设置高低两种突变频率。建议同时对阴性样本进行验证。如果试剂盒可以覆盖多个变异位点的检测，申请人可以对全部变异位点进行精密度验证，也可以选择其中部分变异位点进行验证，但应至少包含常见变异序列或理论上较难测得的变异序列。如果待测物靶核酸为RNA，则弱阳性样本中应至少包含常见主要变异位点。

　　2.6检出限

　　注册人应对试剂盒所覆盖的可检测位点进行检测限的研究。应包括检出限确定和验证研究资料。扩增反应终体系中的变异序列百分率和总核酸浓度两个因素对最低检测限的影响较大，终体系中变异序列的百分率越高、所含的DNA(RNA)量越多，则越容易检出。因此，试剂盒最低检测限主要考虑以下两种情形。

　　2.6.1在扩增反应终体系特定核酸浓度下，变异序列所占百分率的最低检测限。

　　采用野生型临床样本和较高突变百分率的临床样本提取的核酸储备液进行混合，确定扩增反应终体系中的核酸浓度，采用合理的试验方法(如深测序)对混合后样本中变异序列所占百分率进行确认，并逐渐调整野生型和突变型核酸储备液的比例以得到含不同突变序列百分率的混合液。如上述方法不易实现，也可采用含相应变异类型的质粒与基因变异对应的野生型基因组DNA混合的方法来制备相应的混合液。对各份混合液进行不少于20次的重复检测，确定95%阳性检出率水平，作为在固定的核酸浓度条件下，可以检测到的最低的突变序列百分率。

　　举例：在50ng/40μL水平，可以达到95%阳性检出率的最低突变序列百分率为10%。

　　2.6.2在特定突变序列百分率下，反应终体系中核酸浓度的最低检测限。

　　采用合理的试验方法确定待测样本中的突变序列所占的百分率，或采用突变型质粒与野生型基因组DNA按一定比例混合(如固定在10%的水平)，再逐级稀释成不同核酸浓度样本，对不同浓度样本进行多次重复检测，确定适当检出率水平(如：95%)下的最低DNA(RNA)浓度，即为核酸浓度的最低检测限。系列稀释度应能够覆盖大部分检出概率区间(0～100%)，可根据各浓度梯度检测结果直接判定，也可通过概率计算或其他适当方法进行研究。

　　举例：在10%的突变序列百分率水平，40μL扩增反应终体系中，DNA浓度的最低检测限为50ng/40μL。

　　2.6.3系列稀释度应能够覆盖大部分检出概率区间(0～100%)。检出限的声称应同时明确核酸浓度和突变比例。

　　2.6.4检出限的验证

　　选取与建立不同的临床样本对声称可检测的变异位点进行验证，建议对检出限附近浓度水平的样本进行至少20次的重复检测，应满足95%检出率要求。

　　2.7 分析特异性

　　2.7.1野生型验证：采用高低不同浓度的野生型核酸样本进行验证，结果应为阴性或野生型。

　　2.7.2交叉反应，对于此类产品的交叉反应验证主要考虑以下几方面情形：

　　2.7.2.1申报试剂所覆盖的全部突变类型间的交叉反应;

　　2.7.2.2核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反应的野生型或其他突变类型序列间的交叉反应。

　　2.7.2.3对于可能产生交叉反应的病原体，需在有临床意义相关浓度下进行检测，细菌浓度水平建议至少106cfu/mL，病毒浓度水平建议至少105pfu/mL。需明确进行交叉反应的病原体类型及滴度。

　　申请人应提供生信分析结果以及所有用于交叉反应验证的突变或野生型序列来源、序列确认和浓度选择等试验资料。有关交叉反应验证的信息应在产品说明书的【产品性能指标】项中有所体现。

　　2.7.3干扰物质

　　应针对可能的内源和外源性干扰物进行干扰试验研究。

　　2.7.3.1申请人应根据试剂盒所采用的样本类型，确定潜在的干扰物质。如对于外周血样本，内源干扰物主要涉及血脂、胆红素、血红蛋白和白蛋白、人DNA、RNA等，外源干扰物主要包括血液样本采集可能用到的抗凝剂、样本采集和处理期间引入的物质(如样本采集管及保存管中活性成分等)、核酸提取/纯化过程可能含有的干扰物质、常用药物及其代谢物等。对于病理组织，还需考虑病理组织处理过程及样本穿刺过程的缓冲液、处理液、常用治疗药物等;非人源的核酸物质等。

　　2.7.3.2用于干扰试验的样本，靶基因浓度建议采用低突变率条件下包含低浓度在内的至少两个浓度水平，使用高浓度的干扰物质进行验证。此外，建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度(“最差条件”)条件下进行评价，应结合产品的特点及临床用途，设置合理的结果接受标准，如有干扰，应确定不产生干扰的最高浓度。

　　2.8样本核酸分离/纯化

　　样本核酸的分离/纯化主要有以下目的：富集靶核酸浓度、保证靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，样本核酸分离/纯化是决定后续核酸扩增过程成败的要素之一。尤其是石蜡包埋组织样本在福尔马林固定过程中，会使样品中的核酸与核酸之间，核酸与蛋白之间发生交联，同时会引入C>T，G>A的假阳性突变，并且样本在不当的保存条件下容易造成核酸的片段化或降解，增加了核酸分离/纯化的难度。除最大量分离出目的核酸外，还应有相应的纯化步骤，尽可能去除PCR抑制物，以及降低福尔马林固定过程引入的假阳性。常见的核酸分离纯化均有其优势和不足，申请人应结合申报产品的特性，合理选择核酸分离/纯化试剂，无论申报产品是否含有核酸分离/纯化的组分，企业都应提交配套使用的核酸分离/纯化方法的核酸提取性能研究资料，应对核酸提取效率、提取核酸纯度、浓度、片段完整性以及提取重复性等进行充分的验证, 申请人需设置评价方案和评价指标并评价选定的每种核酸提取纯化方法能否满足申报产品的要求，结合配套检测试剂至少对各基因变异类型的检出限、重复性和干扰性进行验证。申请人应明确样本质量评价标准。不同样本类型应分别进行核酸提取/纯化性能的研究验证。

　　2.9反应体系

　　包括分析前样本类型的选择、样本采集、预处理(如有)、样本用量、试剂用量、反应条件、质控体系设置、Ct(临界)值确定等，提供确切的依据。并需明确样本所需达到的质量标准及确定过程。

　　2.9.1基因位点选择、方法学特性介绍。

　　2.9.2提供确定最佳反应体系的研究资料，包括核酸提取用样本体积、洗脱体积、反应体系中的样本用量、试剂用量、添加剂用量(如有)、反应体系各成分终浓度(如酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度等)、反应体积等。设置反应体系需要的核酸含量上限和下限。如反应体系中起始DNA浓度过高，可能导致反应体系发生非特异性扩增，产生假阳性结果。如反应体系中起始DNA浓度过低，可能导致反应体系无靶序列扩增反应，产生假阴性结果。

　　2.9.3提供确定逆转录过程的温度和时间的研究资料(如涉及)，PCR反应体系及检测过程中涉及的反应条件/参数(如PCR反应各阶段温度、时间、循环数、荧光采集时间等)等的研究资料。

　　2.9.4提供质控体系设置、Ct值或靶值确定的研究资料。

　　2.9.5提供不同机型基线、阈值循环数(Ct)、荧光强度(如适用)确定的研究资料。

　　2.9.6不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。

　　2.9.7如申报产品包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进行工艺优化的研究资料。

　　3.稳定性研究资料

　　主要包括实时稳定性(有效期)、使用稳定性(如开瓶稳定性、复溶稳定性(如适用)、机载稳定性(如适用)等)、运输稳定性及冻融次数限制等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

　　4.阳性判断值研究资料

　　对于此类试剂，阳性判断值确定资料包含检测基因变异的阳性判断值与对肿瘤治疗药物伴随诊断用途的阳性判断值。

　　对于检测基因变异的阳性判断值，主要是指Ct值的确认资料，建议申请人采用受试者工作特征(ROC)曲线或其他合理的方式对申报产品用于结果判断的临界值予以确认。如果试剂存在灰区，应解释说明灰区范围的确定方法。应针对不同样本类型(如有)分别进行阳性判断值研究，明确是否有差异。应在独立样本人群中对经研究拟确定的cut-off值进行充分验证。申请人应详述试验方案、样本来源、样本量、样本入组标准及试验结果等。

　　对于肿瘤治疗药物伴随诊断用途的阳性判断值，在设定申报试剂检测结果阳性判断值确定依据时，应包括阳性判断标准研究方案、设定评价标准、研究过程、研究原始数据及统计分析、结果与结论等。方案应考虑不同影响检测结果的因素，如人群流行病学信息、疾病类型等。应列举阳性判断值计算过程中采用的所有统计学方法。如存在不同样本类型，应明确临界值在不同样本类型中是否有差异并提供支持性研究资料。对于原研伴随诊断试剂，结合药物临床试验进行阳性判断值的研究。对于非原研伴随诊断试剂，如申报产品分析灵敏度显著高于原研伴随诊断试剂，则申报产品应依据其伴随诊断用途，参考原研伴随诊断试剂阳性判断值确定合理的用于病例指导用药的阳性判断值

　　5.其他资料

　　5.1主要原材料研究资料

　　此类产品的主要反应成分一般包括人基因组核酸提取/纯化试剂、阴阳性质控品(如包含)、检测所需引物、探针、各种酶、dNTPs等。申请人应提交核心反应体系原材料的选择过程，包括理论分析和试验验证。除核心反应体系原材料之外的其他主要原材料，可免于提交选择过程，直接提交选择后的验证资料。具体要求可参考《体外诊断试剂主要原材料研究注册审查指导原则》。相关原材料的来源、选择、制备方法的研究资料、质量分析证书、质量标准的制定和检验资料等相关研究资料。主要原材料如为申请人自制，其生产工艺必须相对稳定，并应提交自制所需原料及自制过程及工艺稳定性验证报告;如为申请人外购，还应提交供应商筛选资料、供应商提供的质量标准、出厂检验报告，以及申请人出具的该原材料到货后的质量检验资料。供应商应固定，不得随意更换。如适用，提交企业参考品的研究资料，包括来源、组成、阴阳性和/或量值确认等。

　　5.1.1核酸分离/纯化组分(如有)的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。

　　5.1.2脱氧三磷酸核苷(dNTPs)

　　主要包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。如为外购，应提交对纯度、浓度等的质量标准及验证资料;如为自制，需提交自制所需原材料、自制过程、脱氧三磷酸核苷产物鉴定、质量标准(如分子量、浓度、纯度等)制定与验证及功能性验证的资料。

　　5.1.3引物、探针

　　申请人应详述引物探针的设计原则、靶基因座位选择、靶基因信息(基因名称、参考序列号)，同时应提供引物探针核酸序列、模板核酸序列及两者对应关系。结合基因突变位点检测原理，明确各引物探针在检测过程中所起的作用。建议设计多套引物探针以供筛选，针对待测位点的准确性、特异性等进行评价，选择最佳设计，并提交详细的筛选研究数据。

　　申请人应针对选定的引物探针原材料进行质量评价，一般包括：序列准确度、分子量、纯度(探针纯度应达到HPLC纯)、浓度、探针荧光标记物及其激发波长和发射波长(如适用)，以及功能性试验等，并依据评价结果建立合理的质量标准。

　　如为外购，还应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如合成引物探针序列、分子量、序列修饰基团、PAGE结果或高效液相色谱法(HPLC)分析图谱等。

　　5.1.4酶

　　DNA聚合酶，应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，部分酶具有核酸外切酶活性，具热稳定性，如：94℃保温1小时后仍保持50%活性;尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG/UNG)，具有水解尿嘧啶糖苷键的活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性;逆转录酶，具逆转录酶活性，无核酸内切酶活性。应对酶活性、特异性进行合理验证。

　　5.1.5试剂盒内对照品(质控品)

　　试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒对照品来实现，质控体系需考虑对样本核酸分离/纯化、配液及加样、试剂及仪器性能、扩增反应抑制物(管内抑制)、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假阴性或假阳性结果进行合理的质量控制。所有阳性对照品的核酸性质应与待测样本的靶核酸性质一致，如同为DNA或RNA。对照品可采用质粒、细胞系、假病毒或临床样本的核酸提取液等进行配制。申请人应提交试剂盒对照品有关原料选择、制备、定值过程、浓度范围等试验资料，并对质控品的检测结果做出明确的范围要求。申请人应视申报产品具体情况设置合理的试剂盒对照品(质控品)，试剂盒质控体系主要考虑以下几方面要求。

　　5.1.5.1阳性对照品(质控品)

　　建议对每个样品反应管设置至少一份阳性对照品(质控品)，不建议采用质粒。阳性对照应参与样本核酸的平行提取，申请人应对各种阳性对照品(质控品)的Ct值做出明确的范围要求。如样本反应管内可以覆盖多种突变序列的检测(分型或不分型)，相应的阳性对照管应选择较常见突变序列或理论上较难测得的突变序列作为阳性对照。

　　5.1.5.2内对照(内标)

　　内对照(内标)可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，尤其是靶核酸为RNA、用于基因重排或基因表达异常等检测目的时，可以采用管家基因或与靶基因浓度水平相当的其他基因序列作为相应的内对照(内标)。申请人应对内对照(内标)的引物、探针和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制而导致假阴性。

　　5.1.5.3阴性对照

　　阴性对照可以是含有野生型核酸序列的核酸溶液，也可以是空白对照，以对可能存在的交叉污染进行假阳性结果的质控。阴性对照品应参与样本核酸的平行提取。

　　由于临床标本多为经过复杂处理的病理切片或组织，其中核酸的完整性容易被破坏，从而影响后续试验结果，造成假阴性的可能性。因此，除上述对照品外，申报试剂的反应体系中应充分考虑对核酸分离/纯化环节的质量控制，比如，设置专门的质控管或内标对管家基因或其他源于人类基因组DNA的靶序列进行扩增，以对核酸分离/纯化的质量及效率进行评估。

　　5.1.6企业参考品：

　　应详细说明有关企业内部参考品的原料选择、制备过程、定值研究、评价指标、统计学分析等试验资料。申请人应对内部参考品的来源、基因序列设置等信息进行精确的试验验证，并提供参考品溯源过程的测量程序或参考方法的相关信息及详细的验证资料。如该类产品有国家标准品，在不低于国家标准品要求前提下，申请人可以结合实际情况设置合理的企业参考品。代表性位点要求与分析性能中的代表性位点要求一致。

　　具体要求如下：

　　5.1.6.1阳性参考品

　　试剂盒(分型或不分型)所能覆盖的所有突变位点均应设置相应的阳性参考品，每个突变位点设置不同突变百分率梯度，其中至少应包括高浓度和低浓度阳性参考品。阳性参考品的突变形式及拷贝数/浓度需采用有效方法(如测序方法或数字PCR等)确认，并明确接受标准。如为自建方法，需提交自建方法的性能确认资料。

　　如申报试剂用于DNA样本的检测，则阳性参考品可以采用临床样本或其提取的DNA储备液、或细胞系(如有)作为原料。如申报试剂用于RNA样本的检测，阳性参考品可以采用临床样本提取的RNA储备液、相应RNA冻干粉或假病毒的形式;如可以对其中部分罕见突变位点采用质粒的形式，但不能全部采用质粒，需包括部分突变类型(申请人自行确定其代表性)RNA为模板的阳性参考品以对逆转录(RT)过程进行监控。

　　5.1.6.2阴性参考品

　　应考虑检测特异性的评价，纳入同源序列交叉反应样本、干扰样本等。可采用经确认无相应靶突变序列的野生型DNA储备液。

　　5.1.6.3检测限参考品

　　检测限参考品的原料要求参考阳性参考品，需包括所有申报的基因变异位点。对于以一段无突变热点序列的所有突变作为检测靶标(如EGFR 19Del)的情形，则可选择代表性变异进行参考品设置。当设置检测限参考品时，可以仅设置一个浓度水平，该水平可略高于95%的阳性检出率水平，而设置为100%检出，应明确参考品中靶核酸浓度水平和突变百分率。

　　5.1.6.4精密度参考品

　　精密度参考品原料要求参考阳性参考品，需至少包括弱阳性、中或强阳性水平的精密度验证，中/强阳性精密度参考品可不必包括所有突变类型，可选择代表性位点进行精密度参考品的设置。以常见突变类型或理论上较难测得的突变序列为主，但弱阳性参考品需包括所有突变位点;如果产品包含多个反应管，每个反应管应选择代表性的突变类型设置精密度参考品。如有必要，建议同时设置阴性参考品精密度验证。

　　5.2生产工艺研究资料

　　介绍产品主要生产工艺，可用流程图结合文字的方式表述。提交主要生产工艺的确定及优化研究资料。

　　生产工艺研究资料包括工作液配制(引物、探针浓度、酶浓度、dNTPs浓度、缓冲液离子浓度等)、分装和冻干(如有)、荧光标记(如有)等工艺过程的描述及确定依据。生产过程应对关键参数进行有效控制，可采用流程图方式描述生产工艺，标明关键工艺质控步骤，并详细说明该步骤的质控方法及质控标准。

（四）临床试验

　　临床试验的开展、方案的制定以及报告的撰写等均应符合相关法规及《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》的要求。

　　针对与抗肿瘤药物同步研发的伴随诊断试剂，申请人可按照《与抗肿瘤药物同步研发的原研伴随诊断试剂临床试验技术指导原则》开展临床试验，针对非原研伴随诊断试剂申请人可按照《抗肿瘤药物的非原研伴随诊断试剂临床试验注册审查指导原则》开展临床试验。

（五）产品说明书和标签样稿

　　产品说明书格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求产品说明书中相关技术内容应与注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明文献的相关信息。肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂的说明书编写应重点关注以下内容。

　　1.【预期用途】

　　应至少包括以下几部分内容：

　　1.1预期用途：本产品用于体外定性检测人xx(肿瘤名称)xxx(样本类型)样本的xxxx(基因名称)突变基因，可以以列表形式列明具体突变位点。其中yy(具体突变位点或类型)用于yyy(伴随的药物名称)药物的伴随诊断。肿瘤的类别及适用样本类型应结合实际的临床研究完成情况进行确认。

　　1.2适用人群：伴随诊断试剂适用人群应与抗肿瘤药物的适用人群相对应，应为临床上需要进行检测以明确是否能够使用某种抗肿瘤药物的人群。目标人群可能随着个体化药物和试剂发展研究而发生微调，建议申请人参照最新研究指南或专家共识。

　　1.3明确说明该试剂盒仅用于对特定肿瘤患者靶基因序列的检测，其检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯一依据，临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其他实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。

　　1.4临床背景的介绍，包括相关适用人群特征、肿瘤的组织类型、适用的样本类型、待测靶基因序列的特征及选择依据，靶基因及其表达蛋白在恶性肿瘤发生、发展过程中可能起到的作用，相关药物或其他治疗技术及其作用机理、与待测突变位点可能存在的关系等。

　　2.【检验原理】

　　2.1对试剂盒检测能够覆盖的所有突变位点或突变类型进行详细描述(靶序列长度、基因座位、突变类型及相关特征等)，对引物及探针设计、不同样品反应管组合、对照品设置及荧光信号检测原理等进行逐项介绍。明确内标基因名称及其作用。

　　2.2核酸分离/纯化方法、原理等。

　　2.3试剂盒技术原理的详细介绍，建议结合适当图示进行说明。如添加了相关的防污染组分(如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等)，也应对其作用机理作适当介绍。

　　3.【主要组成成分】

　　3.1详细说明试剂盒内各组分的名称、数量、装量各组分内的成分等信息，说明各组分中的核心反应成分、生物活性材料、固相载体、显色/发光物质、基质、防腐剂等信息，必要时，明确组分在基质中的浓度、比例等信息。阴性/阳性对照品(或质控品)可能含有生物源性物质的组分，应说明其生物学来源、活性及其他特性;说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。如试剂盒中包含耗材，应列明耗材名称、数量等信息。

　　3.2试剂盒中不包含但对该项检测必须的组分，如核酸提取试剂、单独注册的校准品/质控品、样本保存液等，注册人应列出相关试剂的产品名称、注册人(备案人)、货号及其注册证编号(备案编号)及其他必要的信息。若有配合使用的单独注册的软件，列明软件名称、发布版本号、注册人、注册证号等信息。

　　3.3如果试剂盒中不包含用于核酸分离/纯化的试剂组分，则应在此注明经验证后推荐配合使用的商品化核酸分离/纯化试剂盒的注册人(备案人)、产品名称以及该产品的货号及其注册证编号(备案编号)等详细信息。4.【储存条件及有效期】

　　试剂盒的效期稳定性、开瓶稳定性、复溶稳定性、运输稳定性、冻融次数要求等。

　　4.【适用仪器】

　　所有适用的仪器型号，并提供与仪器有关的重要信息以指导用户操作。

　　5.【样本要求】

　　重点明确以下内容：

　　5.1对适用的样本类型作详细介绍，包括样本来源及取材要求、样本处理方式(如组织样本的固定及包埋方式)、肿瘤细胞比例等。

　　样本的取材及处理方式等若有通用的技术规范或指南，则应遵循，并在此处引用。

　　5.2样本处理及保存：核酸分离/纯化前样本的预处理、保存条件及期限、运输条件及期限(如适用)等。分离纯化后的核酸如可不立即使用，则需明确其保存条件和保存期限，如冷冻保存，还需明确冻融次数。

　　5.3在核酸分离/纯化过程结束后，应采用适当方法对分离/纯化后的核酸储备液进行质量控制。比如，采用分光光度计法对分离/纯化后的核酸储备液进行浓度、纯度检测，并依据性能验证结果在此给出用于扩增试验的核酸溶液浓度范围要求。举例：扩增反应终体系中需要50ng的脱氧核糖核酸(DNA)量，而在终体系中需加入25μL的DNA储备液，则在DNA分离/纯化完成后应将DNA储备液的浓度调整至2ng/μL的浓度。

　　如分离/纯化后的核酸储备液质量(如浓度范围)不符合要求，应重新取材或扩大样本量再进行核酸分离/纯化。

　　5.4明确操作过程中各种制备液的稳定性要求，如各类混合液(Mix)、DNA/RNA储备液、反应终体系等的保存条件、储存期限及冻融次数(如涉及)。

　　6.【检验方法】

　　详细说明试验操作的各个步骤，包括：

　　6.1试剂配制方法、注意事项。

　　6.2详述核酸分离/纯化的条件、步骤及注意事项，明确核酸提取的样本体积、核酸洗脱体积、明确提取核酸的质量标准。对照品(质控品)应参与样本核酸的平行提取(如有必要)，以对核酸分离/纯化环节进行合理的质量控制。

　　6.3扩增反应前准备：各组分加样体积、顺序、相关注意事项等。

　　6.4逆转录过程(如涉及)的温度和时间设置、PCR各阶段的温度、时间设置、循环数设置及相关注意事项。

　　6.5仪器设置：明确关键参数，待测基因、内标和对照品的荧光通道选择等。

　　7.【阳性判断值】

　　包括基线的确定方法和阈值循环数(Ct)的要求(如适用)。通过扩增曲线和Ct值进行阴阳性的判断。

　　8.【检验结果的解释】

　　结合阳性对照、阴性对照以及样本管中靶基因和内标的检测结果(Ct值)及扩增曲线，对所有可能出现的结果组合及相应的解释进行详述。如存在检测灰区，应对灰区结果的处理方式一并详述。

　　9.【检验方法的局限性】

　　9.1本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者个体化治疗的选择应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

　　9.2阴性结果不能完全排除靶基因突变的存在，样本中肿瘤细胞过少、核酸过度降解或扩增反应体系中靶基因浓度低于检测限亦可造成阴性结果。

　　9.3肿瘤组织(细胞)可能存在较大异质性，不同部位取样可能会得到不同的检测结果。

　　9.4不合理的样本采集、转运及处理，以及不当的试验操作和实验环境均有可能导致假阴性或假阳性结果。

　　9.5明确该检测仅限于规定的样本类型及检测系统(包括适用机型、核酸分离/纯化试剂、检测方法等)。

　　9.6 FFPE样本在固定过程中可能引入新的突变，影响检测性能。建议进行评估和通过相应的方案降低假阳性。

　　10.【产品性能指标】

　　根据研究资料详述以下性能指标：

　　10.1对相应国家标准品(如有)和企业参考品检测的符合情况。

　　10.2最低检测限：说明在试剂盒规定的检测条件及扩增体系中，试剂盒能够覆盖的所有突变类别的最低检出浓度，重点考虑原始模板中突变基因的百分率和扩增终体系中核酸浓度两个因素对最低检测限的影响;并简单介绍最低检测限的确定方法。

　　10.3精密度：简要介绍不同机型、不同样本类型的精密度评价方法和结果。(包括重复性、中间精密度和再现性评价结果)

　　10.4分析特异性

　　对分析性能评估中特异性研究内容进行归纳。

　　10.4.1野生型验证：应采用不同浓度的野生型核酸样本进行验证，其结果应均为阴性,至少包括检测上限和检测下限浓度。

　　10.4.2试剂盒内交叉反应：如考核试剂包括对多个突变位点的检测，则应对该试剂盒覆盖范围内的所有突变类型间进行交叉反应验证。

　　10.4.3序列相近或具有一定同源性的其他较常见突变或野生型基因序列间的交叉反应验证。

　　10.4.4潜在干扰物质验证。

　　如果经验证发现某些序列与靶序列的交叉反应出现阳性结果，则应该对存在交叉反应的核酸序列及浓度进行验证并在产品说明书中表明这种假阳性发生的可能，做出相关的提示。

　　10.5临床试验：简要介绍试验方法、对比试剂(方法)信息、受试者及样本、所采用的统计学方法及统计分析结果和结论等。

　　11.【注意事项】

　　应至少包括以下内容：

　　11.1如该产品含有人源或动物源性物质，应给出具有潜在感染性的警告。

　　11.2临床实验室应严格按照《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》(卫办医政发〔2010〕194号或现行有效版本)等有关分子生物学实验室、临床基因扩增实验室的管理规范执行。

三、参考文献

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　　[8]国家药品监督管理局.与抗肿瘤药物同步研发的原研伴随诊断试剂临床试验技术指导原则：国家药监局通告2022年第28号[Z].

　　[9]国家药品监督管理局.基于同类治疗药物的肿瘤伴随诊断试剂说明书更新与技术审查指导原则：国家药监局通告2021年第24号[Z].

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