一文了解医疗器械体外细胞毒性试验要点

引言

　　体外细胞毒性试验具有通用性，与体内试验方法相比具有简便、快速、干扰少、可避免伦理问题等优点，作为医疗器械生物学评价的常规检测项目，广泛适用于各种医疗器械和材料的评价。

1、为何要进行细胞毒测试？

　　(1)细胞毒性测试可以帮助评估器械材料对人体细胞的潜在毒性，从而确定其在体内使用的安全性。

　　(2)材料选择和优化。细胞毒性测试可以帮助医疗器械制造商选择合适的材料，并优化其设计。通过测试不同材料的细胞毒性，可以选择对人体细胞影响较小的材料，从而减少潜在的生物相容性问题。

　　(3)法规要求。医疗器械生物学安全性评价中要求对医疗器械进行细胞毒性测试，是确保医疗器械的安全性的重要步骤之一。

2、参考标准

　　ISO 10993-5:2009

　　Biological Evaluation of Medical Devices —— Part 5: Tests for in vitro Cytotoxicity

　　GB/T 16886.5-2017

　　医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验

　　GB/T 14233.2-2005

　　医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学试验方法

　　GB/T 16175-2008

　　医用有机硅材料生物学评价试验方法

　　YY/T 0127.9-2009

　　口腔医疗器械生物学评价 第2单元 试验方法 细胞毒性试验：琼脂扩散法及滤膜扩散法

3、细胞毒性试验的方法

　　细胞毒性试验方法分为三类：浸提液法、直接接触法、间接接触法。[1]

　　浸提液法：适合检测可沥滤物的毒性，常使用极性和非极性的含血清的培养基对器械进行浸提，进行试验样品的检验。

　　直接接触法：该方法对材料的细胞毒性敏感性最高，可检测出材料微弱的细胞毒性。

　　间接接触法：分为琼脂扩散法和滤膜扩散法，琼脂扩散法适用于毒性大的大批量材料筛选，滤膜扩散法适合于小分子量毒性材料的评价。

　　针对某些特殊的产品，可能已经具有特定的细胞毒测试方法。例如，接触镜类产品，细胞毒可采用琼脂扩散法(参考标准YY 0719.7-2011 眼科光学接触镜和接触镜护理产品 第7部分：生物学评价试验方法)，某些口腔类产品可能采取琼脂扩散或滤膜扩散法检测细胞毒性(YY/T 0127.9-2009口腔医疗器械生物学评价 第2单元 试验方法)。

　　对于选择哪种方法去评价细胞毒性，各种方法因原理不同，各有特点，应具体根据产品、材料的用途、本身理化性质，考虑试验的原理、灵敏度、可定量性等因素去选择。

4、不同灭菌方式对细胞毒试验结果的影响

　　常用的灭菌方法有辐照灭菌、环氧乙烷灭菌、低温等离子灭菌、高压蒸汽灭菌和紫外等。

　　这些灭菌方式对细胞毒试验结果影响各有不同：

　　辐照灭菌可能对样品中生物材料或高分子材料产生影响，从而影响细胞毒结果;

　　EO灭菌中EO的残留，对细胞可能产生毒性作用，对细胞生长会有一定的影响，需确保EO残留充分去除;

　　低温等离子灭菌残留的气体和化学物质，一定程度上会导致细胞的损伤和死亡;

　　使用高压蒸汽灭菌需考虑高温是否会影响产品本身的性质，存在一定的局限性;

　　紫外照射属于一种物理方式的灭菌，操作简单，使用方便，但其主要针对表面和空气中的微生物，不适用于深层或隐藏的细菌、病毒和真菌，从而造成假阳性的试验结果。

5、非无菌产品测试细胞毒时，需要进行灭菌处理吗？

　　非无菌产品中可能存在生长因子、细菌、真菌，它们的存在可能会对细胞的生长、代谢等产生影响，从而使研究得到假阳性的实验结果。

　　如果样品高温灭菌后或者紫外照射后，对产品本身不会有任何影响，建议采取灭菌措施，排除其中可能存在的微生物和其他影响因素对细胞试验结果的影响。

6、试验样品的浸提

　　浸提介质：优先选用含血清的培养基，是由于该浸提介质具有支持细胞生长以及浸提极性和非极性两种物质的能力。

　　也可以选择其他适宜的浸提介质，包括纯水、生理盐水溶液等，使用该类浸提介质，只能提供极性或者非极性的浸提环境，不能同时包含极性和非极性浸提两种情况、且不能提供支持细胞生长的营养物质，100%样品浸提细胞存活会受到影响。可考虑使用培养基对其进行稀释，但应进行论证并形成文件。

　　浸提条件：常见组合有——

　　(37±1)℃， (24±2)h

　　(50±2)℃， (72±2)h

　　(70±2)℃， (24±2)h

　　(121±2)℃，(1±0.2)h

　　上述浸提条件是基于历史资料，已用于提供器械或材料风险评估中潜在危害的测定。可采用其他条件(例如在37℃时延长或缩短浸提时间)，根据产品接触信息进行选择。

　　如选择的浸提介质是含血清培养基，温度只能选择37℃，温度超过37℃会对血清化学或稳定性以及培养基中其他成分产生不良影响。

7、细胞毒的结果评价和分析

　　可采用定性和定量的方法测定细胞毒性反应。细胞毒性的定量评价更好一些，可以客观地对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放、活体染料的还原或其他可测定的参数进行定量测定，不易受到试验者主观因素的影响，具有相对高的灵敏性且有明确判定限，MTT定量法是国内普遍应用的方法。相对而言，细胞毒性的定性评价具有更多的评价者主观性，更适合筛选用途。

　　定性评价：显微镜检查细胞的形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和胞膜完整性等方面的改变。

　　定量评价：测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞增殖或集落形成。

　　如出现细胞毒性反应，需从以下几点进一步评价，例：

　　附加试验(培养基含血清或不含血清，改变培养基中血清的水平);

　　浸提液分析(如灭菌或其他生产过程残留物);

　　稀释液的浓度反应分析;

　　可沥滤物成分的化学表征。

结语

　　随着医疗器械注册相关法规的更新，医疗器械生物学评价工作要求愈发细致，作为灵敏的生物相容性试验项目，体外细胞毒性试验不同的方法、不同的灭菌方式，对测试结果有着不同的影响，需要根据不同条件制订不同方案以保障评价结果的准确性和适用性。

【参考文献及标准】

　　[1] 于婷，曲守方，黄杰，孙楠，黄清. 医疗器械体外细胞毒性试验相关标准的比较及有关内容的商榷[J]. 国际检验医学杂志，2015,36(6).

　　[2] 徐玉茵，韩颖，田林奇，周静，魏聪，张丹丹. GB/T 16886.5—2017 中体外细胞毒性试验的比较与分析[J]. 医疗卫生装备，2019，40(7)：74-77，93.

　　[3] 张世明，陶树清. 评价医疗器械体外细胞毒性的常用方法概述[J]. 现代医学，2020， Jan; 48( 1) : 146-150.

　　[4] ISO 10993-5:2009 Biological Evaluation of Medical Devices -- Part 5: Tests for in vitro Cytotoxicity

　　[5] GB/T 16886.5-2007医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验

　　[6] GB/T 14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物试验方法

　　[7] GB/T 16175-2008 医用有机硅材料生物学评价试验方法

　　[8] YY/T 0127.9-2009口腔医疗器械生物学评价 第2单元 试验方法 细胞毒性试验：琼脂扩散法及滤膜扩散法

　　来源：嘉峪检测网