人 CDO1 和 HOXA9 基因甲基化检测试剂盒创新体外诊断试剂注册技术审评报告

一、产品概述

（一）产品主要组成成分

　　产品由以下组分组成，主要组成成分见下表。表1.试剂盒主要组成成分

（二）产品预期用途

　　本试剂盒用于体外定性检测人血浆游离DNA中 CDO1和HOXA9 基因的甲基化水平。

　　本产品用于临床上对疑似卵巢癌患者的辅助诊断，检测结果阳性不作为卵巢癌早期诊断或确诊的证据，检测结果阴性也不能排除卵巢癌的可能。该检测不能作为肿瘤早期诊断或确诊的依据，不用于普通人群的肿瘤筛查。

（三）产品包装规格

　　12 人份∕盒、24人份∕盒。

（四）产品检验原理

　　采用重亚硫酸盐转化技术和荧光定量PCR技术对C1 和H9基因的甲基化进行定性检测，具体如下：

　　重亚硫酸盐转化：将提取的血浆样本游离DNA利用重亚硫酸盐转化，使未发生甲基化的胞嘧啶转变成尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶则不会发生转变;

　　荧光定量 PCR：利用特异性引物结合荧光探针技术，检测DNA样本中是否存在发生甲基化的位点。特异性引物能够选择性地扩增发生甲基化的基因，而荧光探针在Taq酶的作用下水解释放荧光，在实时荧光定量PCR仪上进行DNA样本的甲基化检测。

二、临床前研究概述

（一）主要原材料

　　主要原材料包括：甲基化反应液、引物和探针、菌液，均通过外购的方式获得。其中引物和探针由申请人自行设计，由合成公司经过合成和纯化后获得;菌液基因序列由申请人自行设计，由合成公司负责合成提供。

　　申请人对主要原材料进行了供应商的选择，通过功能性实验筛选出合格供应商，制定了各主要原材料的质量标准并经检验合格。

　　企业参考品包括阴性参考品、阳性参考品、精密度参考品以及最低检测限参考品。阴性参考品8 份，包括不同浓度CDO1和 HOXA9甲基化均为阴性的样本，其他常见甲基化基因阳性的样本以及含有内、外源性干扰物质样本。阳性参考品 6份，包括不同浓度不同甲基化比例的CDO1单基因、HOXA9单基因以及CDO1和HOXA9双基因甲基化阳性的样本。精密度参考品3份，包括不同浓度不同甲基化比例的CDO1和HOXA9双基因甲基化阳性样本以及CDO1和HOXA9均为甲基化阴性的样本。最低检测限参考品3份，包括最低检测限水平CDO1单基因、HOXA9单基因、CDO1和HOXA9 双基因甲基化阳性样本。

　　本产品设置了阴性质控品和阳性质控品各 1管，阳性质控品为含相关检测基因甲基化序列的质粒，阴性质控品为纯化水，用于检测过程中的质量控制。

（二）生产工艺及反应体系研究

　　申请人对试剂盒反应体系的研究包括引物探针的浓度确定、反应液用量、样本用量、以及核酸提取试剂盒和亚硫酸盐转化试剂盒的确定等;对PCR反应条件的预变性时间和温度、变性的时间和温度、延伸和荧光采集的时间和温度以及反应循环次数进行了研究。通过功能性实验，最终确定了最佳的反应体系和生产工艺。

（三）分析性能评估

　　分析性能评估包括准确度、精密度、最低检测限、分析特异性等。

　　准确度研究中，使用三批次产品对阳性参考品和阴性参考品进行检测，检测结果显示阳性参考品符合率、阴性参考品符合率均为100%。同时使用若干临床样本对试剂盒准确性进行了研究，结果显示试剂盒检测结果与参比方法结果一致。

　　精密度研究中，采用三批次试剂盒对阴性临床样本、弱阳性临床样本和阳性临床样本进行了连续20天的检测，统计其检测结果，并对批内、批间、日内、日间、不同操作者之间以及实验室间精密度等进行了评价。研究结果显示试剂盒对不同甲基化水平的临床样本检测结果的 Ct值变异系数(CV)均不大于5.0%。

　　最低检测限研究中，使用三批次试剂盒，采用阴性样本和阳性细胞系混合成不同甲基化比例的样本并且采用不同梯度的样本转化量进行检测，最终得出CDO1基因和HOXA9基因最低检出甲基化比例为5%，最低转化量为10ng。

　　分析特异性研究采用三批试剂盒对交叉反应和干扰物质进行了研究，交叉反应研究结果表明本试剂盒与常见甲基化基因无交叉反应。同时，本产品对其他女性生殖道良恶性疾病均具有良好的检测特异性。干扰实验研究结果显示，人血清白蛋白、胆红素、血红素、对乙酰氨基酚、头孢克肟、阿莫西林、胆固醇、甘油三酯、抗 SSB抗核抗体、HAMA(人抗鼠抗体)、ANA(抗核抗体)、顺铂、甲氨蝶呤、紫杉醇等均不影响试剂盒对弱阳性样本和阴性样本的检测结果。

　　包容性研究采用三批次试剂对不同组织类型的卵巢癌样本的适用性进行研究，结果表明均可正常检出，试剂盒适用于不同卵巢癌组织类型的检测。

（四）阳性判断值或参考区间研究

　　阳性判断值的研究采用临床来源的血浆样本 790例，其中包含阳性样本311 例，阴性样本479 例。以病理结果为金标准，采用ROC曲线法确定每个基因Ct值的阳性判断值。申请人对内参基因的范围进行了统计分析，并将内参基因Ct值范围确定为≤34.6。在内参基因符合要求的基础上，利用约登指数最大的原则，确定CDO1 基因Ct值的阳性判断值为<45，HOXA9 基因Ct值的阳性判断值为<45。并对其结果进行了验证。

（五）稳定性研究

　　申请人对本产品的实时稳定性、使用稳定性、运输稳定性等进行了研究，确定了在各种条件下试剂的有效保存时间。

　　实时稳定性研究：采用三批次试剂于-20±5℃条件下避光保存，分别在效期的第0、3、6、9、12和 14个月进行阴性参考品、阳性参考品、最低检测限参考品和精密度参考品检测，均符合要求。确定试剂在-20±5℃条件下避光保存，有效期12个月。

　　此外，申请人对产品的使用稳定性、运输稳定性和样本稳定性分别进行了研究。结果显示，产品的性能均能满足产品说明书的声称。

三、临床评价概述

　　申请人在中国医学科学院北京协和医院、复旦大学附属肿瘤医院、浙江大学医学院附属妇产科医院和中南大学湘雅三医院共四家临床机构完成了临床试验。采用试验体外诊断试剂与卵巢癌临床参考标准进行比较研究，对产品临床性能进行评价。入组病例为有卵巢癌相关症状/体征、临床需进一步检查的疑似卵巢癌患者。样本类型为血浆样本。临床试验共入组受试者1421例，其中临床参考方法确认卵巢癌病例 382例，交界性肿瘤病例87 例。临床确诊为卵巢癌的病例中包括I 期105 例、II期54例、III期 126例、IV期53例;包括不同组织分型的病例，其中卵巢上皮癌331 例、恶性生殖细胞肿瘤18 例、性索间质肿瘤24 例;卵巢上皮癌包括浆液性癌204 例、子宫内膜样癌48 例、透明细胞癌51例、黏液性癌22例;浆液性癌包括低级别浆液性癌22 例，高级别浆液性癌181 例。非卵巢癌病例包括卵巢良性疾病 704例(子宫内膜异位囊肿、炎性包块、畸胎瘤、浆液性或粘液性囊腺瘤等)，其他生殖系统肿瘤(宫颈癌和子宫内膜癌)115 例，生殖系统外其他肿瘤(结直肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等)133 例等。试验结果显示，本产品与临床参考标准相比，针对卵巢癌病例临床灵敏度为93.19%(95%CI：90.19%，95.51% )，针对非卵巢癌或交界性肿瘤病例临床特异度为97.58%(95%CI：96.40%，98.46%);针对交界性肿瘤病例，临床灵敏度为59.77%(95%CI：48.71%，70.15%)。

　　此外，临床试验还纳入 491例疑似卵巢癌病例，采用试验体外诊断试剂与Sanger测序方法进行比较研究，确认本产品的临床检测性能。试验结果显示：针对CDO1基因，阳性病例共289 例，阳性符合率为 100%(95%CI：98.73%，100.00%)，阴性符合率为98.02%(95%CI：95.01%，99.46%);针对HOXA9基因，阳性病例共 284 例，阳性符合率为100%(98.71%，100.00%)，阴性符合率为98.07%(95%CI：95.13%，99.47%)。上述结果显示两者之间具有良好的一致性，本产品临床检测性能满足要求。

　　综上所述，该产品临床试验符合技术审评要求。

四、产品受益风险判定

　　申报产品根据 GB/T 42062-2022 标准的要求、结合 YY/T1437-2023 标准的要求对人CDO1 和HOAX9 基因甲基化检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行产品受益风险判定。

（一）受益评估

　　申报产品用于体外定性检测人血浆游离DNA中 CDO1和HOXA9 基因的甲基化水平。适用于临床上对疑似卵巢癌患者的辅助诊断，尤其是影像学超声检查不典型、无法判断良恶性的患者，使患者多了一种无创性卵巢癌辅助诊断方法的选择。

（二）风险评估

　　根据申请人提供的申报资料，经综合评价，在目前认知水平上，认为该产品上市带来的受益大于风险。但为保证用械安全，基于对主要剩余风险的规避，产品说明书明确局限性。

　　预期用途：本试剂盒用于体外定性检测人血浆游离DNA中CDO1和HOXA9 基因的甲基化水平。

　　本产品用于临床上对疑似卵巢癌患者的辅助诊断，检测结果阳性不作为卵巢癌早期诊断或确诊的证据，检测结果阴性也不能排除卵巢癌的可能。该检测不能作为肿瘤早期诊断或确诊的依据，不用于普通人群的肿瘤筛查。