结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药突变检测试剂盒医疗器械产品说明书

　　本申报属于优先审批项目。依据《医疗器械监督管理条例》(国务院令第739 号)、《体外诊断试剂注册与备案管理办法》(国家市场监督管理 总局令第 48 号)等相关医疗器械法规与配套规章，经对申请人提交的注册申报资料进行系统评价，申报产品符合安全性、有效性的要求，符合现有认知水平，建议准予注册。

附件：产品说明书

　　结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药突变检测试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)说明书

　　以下，并于6个月内完成试验。模板若需长期保存，则置于-70℃以下。反复冻融次数不超过5次。)

　　②用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或吡嗪酰胺阴性/阳性对照5μL。立即盖严管盖。

　　③将已加入模板的PCR薄壁反应管瞬时离心数秒，除去气泡，并转移至PCR扩增区。

　　3：PCR扩增——扩增区

　　扩增与熔解曲线分析步骤为一个程序，在全自动医用PCR分析系统(SLAN-96S;上海宏石医疗科技有限公司)上连续完成。

　　①反应程序设定如下：

体系	本试剂盒反应体系设为25 μL
PCR 反应 程序	阶段	条件	循环数
	UNG处理	50℃ 2分钟	1
	预变性	95℃10分钟	1
	Touchdown 循环程序	95℃10秒	10
		71℃15秒(每个循环下降1℃)
		78℃15秒
	PCR循环程序	95℃10秒	55
		61℃ 26秒，采集FAM、HEX两个通道荧光信号
		78℃15秒
熔解分析程序		95℃ 2分钟	1
		32℃ 2分钟
		32℃~80℃,采集FAM、HEX、ROX、Cy5四个通道荧光信号，升温速率0.04℃/s

　　②程序运行完毕，将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入自封袋，将封口封严，按污染源处理。

【阳性判断值】

　　通过比较所检测样品与当次阳性对照之间熔解曲线rm值的差异(△rm)判断样品是否发生了吡嗪酰胺耐药突变。

　　野生型峰判断值范围：-1.6℃<△rm<1.6℃

　　突变型峰判断值范围：|△rm|≥1.6℃

　　阳性对照在A、B、C体系及各通道中共36个熔解峰的rm值范围如下表1所示：

　　表1阳性对照在A、B、C体系及各通道中的36个熔解峰的rm值范围

体系	通道	rm值(℃)
		rm1		rm2		rm3
A	FAM	46.1±1.6	（1）	58.5±1.6	（3）	69.2±1.6	（8）
	HEX	46.0±1.6	（14）	58.3±1.6	（17）	68.5±1.6	（34）
	ROX	52.7±1.6	（24）	61.8±1.6	（12）	67.8±1.6	（32）
	Cy5	50.2±1.6	（26）	61.6±1.6	（21）	70.6±1.6	（5）
B	FAM	53.3±1.6	（11）	60.5±1.6	（2）	67.7±1.6	（36）
	HEX	48.2±1.6	（27）	58.2±1.6	（33）	67.2±1.6	（31）
	ROX	55.0±1.6	（18）	63.2±1.6	（6）	70.8±1.6	（29）
	Cy5	51.0±1.6	（15）	60.7±1.6	（9）	68.6±1.6	（22）
C	FAM	45.7±1.6	（10）	58.9±1.6	（16）	68.9±1.6	（23）

	HEX	50.1±1.6（35）	62.4±1.6（7）	73.3±1.6（25）
	ROX	45.6±1.6（20）	59.3±1.6（28）	65.5±1.6（30）
	Cy5	50.7±1.6（13）	59.2±1.6（4）	69.0±1.6（19）

　　注：括号内为对应熔解峰的序列号，按其在基因上的排列顺序从1~36。

　　阳性对照和阴性对照在反应体系D中仅以Ct值(扩增信号)为判读依据，其Ct值范围如表2所示：

　　表2 阳性对照和阴性对照反应体系D的Ct值范围

类型	FAM通道	HEX通道
阳性对照	<18.5	<27.0
阴性对照	无信号	<27.0

　　本说明书中各rm值是在全自动医用PCR分析系统(SLAN-96S;上海 宏石医疗科技有限公司)上所得的常见值作为参考值。当次实验rm值以仪器自动判读所得为准。

【检验结果的解释】

　　检验结果可由软件自动输出，也可人工判读，判读结论与检验结果对照可见附表一。

　　1. 阳性对照的判读：A、B、C三管共计十二个检测通道中均有对应熔解峰，D管在FAM和HEX通道中均有扩增信号，且以上均符合阳性对照rm值和Ct值范围规定，则可判定为阳性质控合格。否则为阳性质控不合格，则判定该次实验结果无效。

　　2.阴性对照的判读：阴性对照加入的是不含模板的DNA溶解液，因反应体系D 中加入外源内控，可对反应体系进行质量控制，同时可质控样品在加样操作过程中是否发生了污染或空气中气溶胶的污染。若阴性对照除了D-HEX有扩增信号外，其他任一通道出现熔解峰或D-FAM出现扩增信号，则为阴性质控不合格，提示操作环境中可能有核酸污染，同步检测的样本可能出现假阳性的结果，则判定该次实验结果无效。

　　3. 待检样本结果判读：

　　野生型峰：A、B、C三管十二个通道中的rm值与阳性对照的rm值均一致(-1.6℃<△rm<1.6℃);

　　突变型峰：不在野生型峰参考值范围内的即为突变型峰(|△rm|≥1.6℃)。

　　当待检样本的A、B、C三管十二个通道中的rm3出现rm值大于等于阳性对照1.6℃及以上时，则表明样本异常，结论为样本无效，请检查样本质量;建议重新提取后进行检测。

　　在此基础上，样本耐药判读有如下情况：

　　(1)不存在峰缺失情况(熔解峰总数≥36个)

　　①当A、B、C三管十二个通道中，每个通道均存在3个野生型峰，不存在突变型峰的情况下，判定为野生型，待检样品对吡嗪酰胺敏感。

　　②当A、B、C三管十二个通道中，每个通道至少有3个熔解峰，且其中存在一个及一个以上突变型峰时，判定为突变型，待检样品对吡嗪酰胺耐药;

　　(2)存在峰缺失情况(熔解峰总数<36个)

　　①当D-FAM通道Ct值<25.2且D-HEX通道Ct值<27.0时，若A、B、C三管十二个通道中存在1个或2个熔解峰缺失，则可能为目标熔解峰存在突变，刚好与临近野生型峰重合，结论为待检样品对吡嗪酰胺耐药;若A、B、C三管十二个通道中存在3个及以上熔解峰缺失，且参考表1峰序列号

　　为连续缺失峰时，则可能目标序列存在短片段缺失，结论为待检样品对吡嗪酰胺耐药;若缺失峰不连续，结论为吡嗪酰胺耐药性不明确，建议重新提取后检测或采用其他方法验证。

　　②当D-FAM通道Ct值≥25.2且D-HEX通道Ct值<27.0时，若A、B、C三管十二个通道中存在熔解峰缺失，则表明样本浓度低，结论为吡嗪酰胺耐药性不明确，建议重新提取样本后检测。

　　③当D-HEX通道Ct值≥27.0或无扩增信号时，若A、B、C三管十二个通道中任一通道出现熔解峰数<3时，提示扩增发生了抑制，导致目的基因和内控均为阴性或无信号，结论为样本抑制，建议适当稀释后重检。

　　若被检测样品出现无熔解峰的情况，除了上述几种情况外，其他可能的原因：1、样品中不含结核分枝杆菌或结核分枝杆菌样品进行提取后加入反应体系的量低于本产品的检测灵敏度;2、样品提取及加样实验操作失误。当以上情况出现时，需要对相应样品进行重新提取并再次检测。若阳性对照无熔解峰出现，在试剂准备和加样操作均正确的情况下，则表明试剂盒失效。

　　实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果;试剂运输、保存不当或试剂配制不准确会引起试剂检测效能下降，出现假阴性或检测不准确的结果。

【检验方法的局限性】

　　1. 由于本试验只筛选核酸序列而不是氨基酸序列，因此，有可能不引起氨基酸改变的突变(沉默突变)也会被判为突变型。

　　2. 当A、B、C三管中36个熔解峰熔点与当次实验阳性对照均一致(误差不超过1.6℃) ,但某个通道熔解峰峰高显著低于阳性对照时，可能为吡嗪酰胺异质性耐药，建议采用其他方法进一步验证。

　　3. 本方法的特点是根据熔解曲线熔点的变化进行结果判读，由于非检测具体突变位点及异质性情况的复杂性，因此本体系对于异质性耐药不做判读。

　　4. 本试验仅检测结核分枝杆菌由pncA基因全基因共187个氨基酸密码子 区域内(561 bp，吡嗪酰胺耐药决定区)和启动子区域-1~-16(16 bp)的突变引起的耐药，由其他基因或基因区引起的突变以及其他吡嗪酰胺耐药机制引起的耐药本试验不能检测。

　　5. 鉴于现有文献和研究资料无法证明，被测区域中每个碱基的突变均能导致吡嗪酰胺耐药，而方法学不能区分具体突变位点，因此报告为突变的结果并不绝对表示耐药。

　　6. 由于检测靶基因的差异和试剂灵敏度的不同，分子生物学方法鉴定为结核分枝杆菌阳性的痰样本，本试剂盒存在检测结果无效的可能，出现这种情况时需重新采集痰液样本提取核酸后检测，或采用其他方法进行确定。

【产品性能指标】

　　1. 重复性：检测重复性参考品，结果为对应的野生型/突变型，并且A、B、C三管的Tm值的变异系数CV值均应不高于2.0%，D管FAM、HEX通道的Ct值的变异系数CV值均应不高于5.0%。

　　2. 特异性：1)交叉反应：根据指导原则要求，对临床痰液样本中可能存在试剂盒声称以外的其他分枝杆菌或其他病原体的相关情况进行验证。用于交叉反应的其他分枝杆菌共计17种(包括堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、土地分枝杆菌、次要分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、苏加分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、偶然分枝杆菌、胃分枝杆菌、胞内分枝杆菌、草分枝杆菌，浓度均为107 个菌/mL)，检测结果均为无效结果，不产生交叉反应;对出现在相应临床标本中可能产生交叉反应的常见病原体(包含肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、隐球菌、金黄色葡萄球菌、诺卡氏菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、烟曲霉，浓度均为107个菌/mL;以及人流感病毒A、B型及人类副流感病毒1、2、3型，浓度均为107copies/mL)进行验证，检测结果均为无效结果，不产生交叉反应。2)干扰试验：样本中常见的干扰物质如 利福平(9mg/L)、异烟肼(12mg/L)、乙胺丁醇(8mg/L)、阿莫西林(11mg/L)、羟甲唑啉(1mg/L)、莫匹罗星(20mg/L)、吡嗪酰胺(45mg/L)、扎那米韦(0.5mg/L)、地塞米松(20mg/L)等药物及血液30% (v/v)、粘液30% (v/v)、人细胞(1×106/L)、液体培养基4% (v/v)，对检测结果均无影响。

　　3. 试剂盒最低检测限为：102CFU/mL;最低检出耐药比例为：50%(pncA389T>G)。

　　4. 临床评价：本产品在三家临床单位共计检测并纳入统计了877例临床培养物样本和720例临床痰液样本。与药物敏感性试验检测结果对比，本产品检测临床培养物样本吡嗪酰胺耐药的临床灵敏度为93.28%，特异度为98.56%，总符合率为97.04%;检测临床痰液样本吡嗪酰胺耐药的临床灵敏度为94.41%，特异度为98.34%，总符合率为97.36%。与核酸序列测定结果对比，本产品检测临床培养物样本吡嗪酰胺耐药的临床灵敏度为98.39%，特异度为100%，总符合率为99.54%;检测临床痰液样本吡嗪酰胺耐药的临床灵敏度为98.34%，特异度为100%，总符合率为99.58%。

【注意事项】

　　1. 本试剂盒仅用于体外诊断，操作人员必须经过培训并具有一定的经验，试剂盒使用前请仔细阅读说明书。

　　2. 请严格按照基因扩增检验实验室的管理规范进行试验操作：如PCR 试验严格分区操作;各区应有专用的手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染;工作人员应遵循从一区到二区的单方向工作原则，各工作区相对隔离;进行PCR试验的工作桌面及相关物品应定期用1%次氯酸钠、75%酒精、1mol/L盐酸或紫外灯进行灭菌和消毒。

　　3. 试验操作所需的消耗用品应一次性使用，使用前进行无菌处理。

　　4. 试剂盒中各试剂在使用前应充分融化，并振荡混匀，短暂离心。反应液分装时应尽量避免产生气泡。PCR反应管加入模板后应瞬时离心，上机前应避免振摇，应注意检查各反应管是否盖紧，以免污染仪器。

　　5.PCR 反应液应避光保存，每次试验应设置阴性对照和阳性对照。

　　6. 不同批号的试剂请勿混用，请在有效期内使用试剂盒。

　　7. 尽量避免反复冻融，应控制反复冻融次数≤4次。如果需要多次使用，请在第一次融解后将制品分装冻存，再根据需要取用。

　　8. 反应结束后，需将PCR薄壁反应管(闭管)取出放入自封袋，将封口封严，按污染源处理。

【参考文献】

　　[1] Louw GE, WarrenR M,DonaldP R,etal.Frequencyandimplicationsofpyrazinamideresistanceinmanagingpreviouslytreatedtuberculosispatients [J]. Int J Tuerc Lung Dis,2006,10(7):802-807.

　　[2]SreevatsanS, PanX,Zhang Y, etal.Mutationsassociated withpyrazinamideresistanceinpncAofMycobacteriumtuberculosiscomplex organisms[J]. Antimicrob Agents Chemother,1997,41(3):636-640.

　　[3] Portugal I,BarreiroL,Moniz-PereiraJ,etal. pncAmutationsinpyrazinamide-resistantMycobacteriumtuberculosisisolatesinPortugal[J].

　　Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004, 48(7):2736-2738.

【基本信息】

　　注册人/生产企业名称：厦门致善生物科技股份有限公司

　　住所：厦门火炬高新区(翔安)产业区莲亭路884-2号

　　联系方式：

　　售后服务单位名称：

　　联系方式：

　　生产地址：厦门火炬高新区(翔安)产业区莲亭路884-1号及884-2号

　　生产许可证编号：

　　【医疗器械注册证编号/产品技术要求编号】

　　【说明书批准日期/生效日期及修改日期】

　　附表一：判读结论与检验结果对应表

判读结论	检验结果
结果无效	①缺少阳性对照或阴性对照； ②阳性对照质控不合格； ③阴性对照质控不合格。
样本无效，请检查样本质量	A、B、C三管十二个通道中的Tm3出现Tm值大于等于阳性对照1.6℃及以上。
吡嗪酰胺敏感	A、B、C三管十二个通道中，每个通道均存在3个野生型峰，不存在突变型峰。
吡嗪酰胺耐药	A、B、C三管十二个通道中，每个通道至少有3个熔解峰，且其中存在至少一个突变型峰。
	当D-FAM通道Ct值＜25.2且D-HEX通道Ct值＜27.0时，若A、B、C三管十二个通道中存在1个或2个熔解峰缺失，则可能为目标熔解峰存在突变，刚好与临近野生型峰重合。
	当D-FAM通道Ct值＜25.2且D-HEX通道Ct值＜27.0时，若A、B、C三管十二个通道中存在≥3个熔解峰缺失，且参考表1峰序列号为连续缺失峰时，则可能目标序列存在短片段缺失。
吡嗪酰胺耐药性不明确，建议重新提取后检测或采用其他方法验证	当D-FAM通道Ct值＜25.2且D-HEX通道Ct值＜27.0时，若A、B、C三管十二个通道中存在≥3个熔解峰缺失，且缺失峰序号不连续。
	当D-FAM通道Ct值≥25.2且D-HEX通道Ct值＜27.0时，若A、B、C三管十二个通道中存在熔解峰缺失，则表明样本浓度低。
样本抑制，建议适当稀释后重检	当D-HEX通道Ct值≥27.0或无扩增信号时，若A、B、C三管十二个通道中任一通道出现熔解峰数＜3时，提示扩增发生了抑制，导致目的基因和内控均为阴性或无信号。