人类免疫缺陷病毒 1 型（HIV-1）DNA 检测试剂盒（PCR-荧光探针法）产品说明书

　　【产品名称】

　　人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)DNA 检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

　　【包装规格】

　　24 人份/盒;48人份/盒。

　　【预期用途】

　　本产品用于体外定性检测人全血样本中的人类免疫缺陷病毒1型脱氧核糖核酸(HIV-1DNA)(仅M组)。本产品用于 HIV-1型(M组)感染的辅助诊断。

　　人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type1，HIV-1)感染是严重危害人类健康的全球问题，自1981 年在美国被识别并发展为全球大流行至今，已累计导致几千万人死亡。HIV-1DNA 检测可用于人群HIV-1抗体筛查有反应性结果的确证检测及高危人群抗体筛查无反应性结果的筛查(窗口期)，用于HIV 抗体检测不确定结果的辅助诊断。

　　本产品仅用于 HIV-1 型感染的辅助诊断，临床医生可参考本产品检测结果，结合病例的实际情况及多方检查结果进行综合判断。本试剂盒检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。本试剂盒不可作为血液或血液制品HIV筛查使用。

　　【检验原理】

　　本试剂盒利用荧光PCR技术，针对人类免疫缺陷病毒 1型基因设计特异性引物和探针，配以热启动DNA聚合酶等成分组成核酸扩增试剂，使用荧光PCR 仪进行PCR扩增，并检测荧光信号，从而对HIV-1 DNA 进行检测。

　　本试剂盒添加了相关的防污染组分(尿嘧啶糖基化酶)，其作用机理是选择性水解断裂含有 dU 的双链或者单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。

　　【主要组成成分】

规格	组分名称		规格	数量	主要成分
24 人份/盒	PCR检测试剂	HIV-1 DNA 反应液A	459μL/管	1	三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、特异性引物和探针
		HIV-1 DNA 反应液B	102μL/管	1	热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶和dNTPs
		HIV-1 DNA内标溶液	270μL/管	1	含HIV-1 DNA内标片段的质粒
	质控品	阴性质控品	400μL/管	1	纯化水
		HIV-1 DNA 阳性质控品	200μL/管	1	8E5 细胞核酸、含HIV-1 DNA内标片段的质粒
48 人份/盒	PCR检测试剂	HIV-1 DNA 反应液A	918μL/管	1	三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、特异性引物和探针
		HIV-1 DNA 反应液B	204μL/管	1	热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶和dNTPs
		HIV-1 DNA内标溶液	270μL/管	1	含HIV-1 DNA内标片段的质粒
	质控品	阴性质控品	400μL/管	1	纯化水
		HIV-1 DNA 阳性质控品	200μL/管	1	8E5 细胞核酸、含HIV-1 DNA内标片段的质粒

　　注：(1)不同批号试剂盒的以上成分不可以互换使用。

　　(2)需自备的试剂：核酸提取或纯化试剂，使用本公司生产的核酸提取或纯化试剂(备案号：粤穗械备20170666号)。

　　(3)质控品说明：HIV-1DNA阳性质控品为8E5 细胞核酸和含HIV-1DNA内标片段的质粒，阴性质控品为纯化水，不具有生物活性，但使用时均应视为具有潜在传染性的物质，操作和处理均需符合相关法规要求。

　　【储存条件及有效期】

　　试剂盒保存于-20±5℃,有效期为12 个月。

　　试剂盒应避免反复冻融，反复冻融次数不超过8次;在2~8℃下可以保存 14天;在37℃下可以保存72小时;开瓶次数不超过4次;-20±5℃运输条件下6天内不影响本试剂盒的检测性能。

　　试剂盒生产日期和失效日期见产品标签。

　　【适用仪器】

　　ABI 7500，AGS4800，BIO-RAD CFX96 DeepWell

　　【样本要求】

　　1. 适用样本：人全血样本。

　　2. 样本采集：抽取受检者静脉血不少于1 mL 注入EDTA 抗凝管中，立即轻轻颠倒玻璃管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。

　　3. 样本的保存：可立即用于核酸提取。提取前样本保存：在2～8℃保存期为1个月;在-20±5℃保存期为12 个月;在-70±5℃保存期为5 年。样本反复冻融不超过5次。提取后核酸保存：在2～8℃保存期为24小时;在-20±5℃保存期为30天;在-70±5℃或-80±5℃保存期为24个月。

　　【检验方法】

　　1.PCR 试剂准备(试剂准备区)

　　从试剂盒中取出HIV-1DNA 反应液A、HIV-1 DNA 反应液B、HIV-1 DNA内标溶液、阴性质控品、HIV-1 DNA阳性质控品，室温融化后振荡混匀，瞬时离心数秒后使用。

　　取N 个(N=待测样本个数+阴性质控品+HIV-1DNA阳性质控品)反应管，

　　单人份PCR 反应液配制如下表：

组分	HIV-1 DNA 反应液A	HIV-1 DNA 反应液B	总体积
用量	17μL	3μL	20μL

　　将各组分充分混合，3,000 rpm离心数秒，将管壁上的液体全部离心至管底，将20μL 反应液分装到PCR 管中即可。如分装好的PCR 反应液不立即使用应放置在2～8℃不超过4小时，室温放置不应超过1小时。

　　2.样本处理和核酸提取(样本制备区)

　　采用本公司生产的核酸提取或纯化试剂(备案号：粤穗械备20170666号)，具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行，阴性质控品需要与待测样本同步进行处理。本试剂盒中的内标溶液参与提取过程，用于提取过程及PCR 扩增全过程的监控，若提取试剂说明书中未说明内标的使用方法，每个测试应加入5µLHIV-1 DNA内标溶液后进行核酸提取。建议采用分光光度计(如NanoDrop2000 超微量分光光度计或其他分光光度计仪器)对提取后的核酸进行检测，核酸的纯度应满足A260/A280比值范围在1.6~2.2之间。

　　本试剂盒中的阴性质控品参与提取，用于对环境进行监控。

　　3. 加样(样本制备区)

　　往分装有20µL 扩增体系的PCR 反应管中分别加入阴性质控品、HIV-1 DNA阳性质控品和待测样本核酸(推荐浓度大于20 ng/µL)各40 µL，使各反应总体积为60 µL。盖紧管盖，瞬时离心后转移至扩增检测区。

　　4.PCR 扩增(PCR 扩增区)

　　4.1 将PCR 反应管放入仪器样品槽内。

　　4.2 仪器设置

　　4.2.1 ABI 7500 仪器设置

　　1)先开电脑，再开定量PCR 仪主机电源，最后启动ABI 7500 软件。

　　2)新建文件：菜单File → NewExperiment 中选择Advanced Setup，打开一个空白文件，在“Experiment Name”中编辑实验名。

　　3)打开“Plate Setup”窗口，点击Add New Target按钮，新建探针，探针检测模式设置为：Reporter1：FAM，Quencher

　　1：none，Reporter 2：VIC ，Quencher 2：none;点击“Assign Target Samples”按钮，按样本对应顺序设置阴性质控(NTC)、阳性质控以及未知样本(Unknown)，并在“Sample Name”一栏中设置样本名称，Passive Reference：none。

　　4)打开Run Method窗口，设置反应体积为60µL，并设置循环条件如下：

步骤	温度(℃)	循环数	时间	备注
1	55℃	1	00:02:00	/
2	95℃	1	00:15:00	/
3	94℃	45	00:00:15	/
	55℃		00:00:45	收集荧光

　　5)设置完成后，保存文件，运行程序。

　　4.2.2 AGS4800 仪器设置

　　1)先打开电脑，再打开定量PCR 仪主机电源，最后启动AGS4800软件，选择对应的层(上、中、下)。

　　2)点击“新建”，在试验名称中编辑实验名、文件路径，保存后点击确定打开一个空白文件。

　　3)点击对应层次后的“锁头”，打开扩增仪器，将反应管放入仪器样品槽内。再点击“锁头”，关闭扩增仪器。

　　4)打开“程序参数”窗口，扩增参数如下：

步骤	温度(℃)	Cycles	时间	备注
1	55℃	1	00:02:00	/
2	95℃	1	00:15:00	/
3	94℃	45	00:00:15	/
	55℃		00:00:45	收集荧光

　　“加液量”设定为60μL。

　　4.2.3 BIO-RAD CFX96 Deep Well仪器设置

　　1)打开Bio-rad CFX Manager 软件，选择运行模式为“User-defined”。

　　2)设置循环条件：

步骤	温度(℃)	Cycles	时间	备注
1	55℃	1	00:02:00	/
2	95℃	1	00:15:00	/
3	94℃	45	00:00:15	/
	55℃		00:00:45	收集荧光

　　3)点击下一步，编辑版位“Plate”，选择“Create New”，选择上机孔位，选择“Select Fluorophores”后，勾选荧光通道FAM、VIC，

　　点击“OK”;在“Sample Type”按样本对应顺序设置阴性质控品(NTC)、未知样本(Unknown)、HIV-1 DNA阳性质控品(Positive Control);再为荧光通道FAM 设置Target Name 为1 后勾选，为荧光通道VIC 设置Target Name为2 后勾选;最后在“Sample Name”一栏中设置样本名称。

　　4)点击下一步，保存文件，运行程序“Start Run”。

　　其他适用仪器的设置，请参考仪器使用说明书。

　　5.结果分析

　　运行结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start、End 值以及Threshold(用户可根据实际情况自行调整，Start 值可以在3~15、End 值可设在5~20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value 值，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在Report 界面查看结果，记录未知样本Ct 值。

　　6. 质量控制

　　6.1 阴性质控品：FAM 通道无扩增曲线，VIC 通道有明显扩增曲线且Ct值≤35。

　　6.2 HIV-1 DNA阳性质控品：FAM 通道有明显扩增曲线，Ct 值在26~30范围内;VIC 通道有扩增曲线，Ct值在30~34范围内;

　　在以上各项同时满足的条件下，本次检测实验有效，否则全部实验应重新进行。

　　7.结果判断

　　7.1阴性结果判定：如果FAM 通道无扩增曲线，无Ct 值或Ct 值>43，且在VIC 通道有明显扩增曲线，Ct 值≤

　　35，则判断样品为HIV-1 DNA阴性。

　　7.2阳性结果判定：如果FAM 通道有扩增曲线，Ct 值≤43，判断样品为HIV-1 DNA阳性。

　　7.3 若VIC 通道无扩增曲线或Ct 值>35，且FAM 通道也无扩增曲线，则表明样本质量可能存在问题，如样本中存在抑制物，建议确认样本质量后，重新进行实验。

　　【阳性判断值】

　　根据临床样本的检测结果，利用ROC曲线法最终确定本试剂盒目的基因的阳性判断值为43;利用T 检验方法最终确定本试剂盒内标基因的阳性判断值为35。

　　【检验结果的解释】

　　1.每次实验前均需检测阴性质控品，HIV-1DNA阳性质控品，质控品结果满足质量控制要求时方可进行检测结果的判定。否则，本次试验无效，建议重新进行检测。

　　2.本次试验仅供临床参考，如需确诊病例请结合临床症状或其他检测手段。

FAM通道	VIC通道	检验结果的解释
Ct值≤43	Ct值≤35	HIV-1 DNA阳性。
Ct值≤43	无Ct 值或Ct值＞35	HIV-1 DNA阳性。本试剂盒反应液中带有内标引物和内标探针，内标通道（VIC 通道）检测对象为内标序列，当FAM 通道有对数增长期曲线时，由于体系的竞 争关系，内标通道可能为阴性。
无Ct 值或Ct值＞43	Ct值≤35	HIV-1 DNA阴性。
无Ct 值或Ct值＞43	无Ct 值或Ct值＞35	体系可能受抑制或操作失误，试验无效，需确认样本质量后，重新进行实验。

　　【检验方法的局限性】

　　1. 本试剂盒的检测结果仅供临床参考，医生应综合病史、查体及其他辅助检查结果进行临床诊断。

　　2. 样本浓度超出本试剂盒检测范围的样本无法确保检测结果的准确性。

　　3. 不合理的样本采集、转运及处理，以及不当的试验操作和实验环境均有可能导致假阴性或假阳性结果。

　　4. 服用阻断剂后抑制病毒复制，可能存在样本中HIV-1DNA 浓度低于最低检测限而检测不到的情况。

　　【产品性能指标】

　　1.最低检测限：采用临床样本进行最低检测限的确认和验证，最终确定本试剂盒的最低检测限为250 copies/mL。

　　2.阳性符合率：检测8 份企业阳性参考品(P1～P8)，检测结果均为HIV-1 DNA 阳性。

　　3.阴性符合率：检测7 份企业阴性参考品(N1～N7)，检测结果均为HIV-1 DNA 阴性。

　　4. 精密度：使用高浓度、低浓度阳性临床样本及阴性临床样本分别进行批内、批间、不同操作者之间、日内、日间、实验室内和实验室间的精密度检测，检测结果显示：高浓度、低浓度临床样本目的基因FAM通道Ct值的变异系数CV%值均不大于5%;阴性临床样本目的基因FAM 通道Ct 值均为阴性。

　　5.交叉反应及竞争性干扰：检测甲型流感病毒(1×107copies/mL)、甲型肝炎病毒(1×107copies/mL)、乙型肝炎病毒(1×107IU/mL)、丙型肝炎病毒(1×107IU/mL)、巨细胞病毒(1×107copies/mL)、EB 病毒(1×107copies/mL)、结核分枝杆菌(1×107copies/mL)、Ⅰ型单纯疱疹病毒(1×106TCID50/mL)、Ⅱ型单纯疱疹病毒(1×106TCID50/mL)、水痘带状疱疹病毒(1×106 TCID50/mL)、马尔内菲青霉菌(马尔尼菲篮状菌)(1×105 CFU/mL)、人乳头瘤病毒(1×107copies/mL)、人细小病毒B19(1×106 IU/mL)、白色念珠菌(1×106 CFU/mL)、风疹病毒(1×106 TCID50/mL)、肺炎支原体(1×106CFU/mL)、新生隐球菌(1×106CFU/mL)、HIV-2型(1×105 IU/mL)、麻疹病毒(1×106TCID50/mL)、卡氏肺孢子菌(1×106 copies/mL)、弓形虫(1×106 copies/mL)、鸟分枝杆菌(1×105 CFU/mL )，检测不在本试剂盒检测范围内的HIV-1型 N 组(1×107 copies/mL)及HIV-1型 O 组(1×104copies/mL)，结果显示：本试剂盒与上述病原体无交叉反应或竞争干扰。

　　6. 抗干扰性：检测含有内源性物质的临床样本，包括16.5g/dL 血红蛋白、20.0mg/mL 胆红素、30.0g/L 甘油三酯、17.0 g/L 总G型免疫球蛋白、3.0 g/L 总M型免疫球蛋白、500IU/mL类风湿因子(RF)、40 ng/mL抗核抗体(ANA)、550 ng/mL 人抗鼠抗体(HAMA)，结果显示：上述内源性物质对本试剂盒检测结果均无干扰。检测含有外源性物质的临床样本，包括1.5μg/mL 拉米夫定、24.66ng/mL阿得福韦、6.7ng/mL 恩替卡韦、4.94μg/mL替必夫定、14.2μg/mL α-干扰素、5 mg/L 依法韦仑、13.5μg/mL 洛匹那韦、5000 ng/mL多替拉韦钠片、67.5 mg/L艾博韦泰、13μg/ml阿奇霉素、2 mg/L 利巴韦林、3 mg/L 伐昔洛韦、400 ng/ml奥司他韦、1.2 mg/L阿昔洛韦、300μg/mL阿司匹林、10 ug/m1洛索洛芬、19μg/mL 布洛芬、1 mg/L 甲氧苄啶、9 mg/L 异烟肼、11 mg/L 利福平、30μg/mL阿米卡星、10mg/L更昔洛韦、60μg/ml 磺胺嘧啶、8mg/L 氟康唑、40ng/mL 地塞米松和90mmol/L乙醇，检测结果显示：上述外源性物质对本试剂盒检测结果均无干扰。

　　7.临床评价：

　　申请人在4 家机构进行了临床试验，采用试验体外诊断试剂分别与一代测序和临床参考标准进行比对研究。

　　针对与一代测序的比较研究，共纳入1269 例样本，二者的阳性符合率为100%，阴性符合率为99.12%。

　　针对与临床参考标准的比较研究，共纳入 1269 例病例，临床灵敏度为96.9%，临床特异度为100%。

　　【注意事项】

　　1.本试剂盒仅用于体外检测。临床实验室应严格按照有关分子生物学实验室、临床基因扩增实验室的管理规范执行。

　　2.实验前请仔细阅读本说明书。

　　3.为了避免样本中任何潜在的生物危险，检测样品应视为具有传染性物质，避免接触到皮肤和粘膜;样本的处理建议在可防止气雾外流的生物安全柜中操作，操作中使用的试管、吸头丢弃前需经灭菌处理。标本的处理和检测标本的容器、检验过程中使用的材料的处理要符合《病原微生物实验室生物安全通用准则》、《医疗废物管理条例》和《医疗卫生机构医疗废物管理办法》，以及国家、地区的相关要求。

　　4.试剂盒中组分需在有效期内使用，不使用本试剂盒提供的组分进行实验将可能导致错误结果。

　　5.实验人员必须进行专业培训。PCR 实验应分别在样品制备区，试剂准备区，扩增区和产物分析区进行，各区应相对分隔。人和实验用物品应从试剂准备区、样品制备区、扩增区到产物分析区单向流动，PCR 试剂盒不可存放于产物分析区。

　　6.全程应避免DNA 酶污染，实验过程中穿工作服，佩戴一次性手套和口罩。在洁净消毒、紫外线灯杀菌的化学通风橱或生物安全柜完成操作，避免有害物质进入呼吸道。标本处理区应安装负压超净工作台。实验过程中必须穿工作服，各实验区工作服应分开。实验过程应戴一次性手套，使用自卸管移液器。

　　7.所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用。

　　8.对每次实验应进行质量控制。

　　9. PCR 检测试剂使用前要完全解冻，离心数秒后使用，但应避免反复冻融。

　　10.标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃;实验完毕应用 10%次氯酸或70%酒精或紫外线灯处理工作台和移液器。

　　11.完成样本核酸提取后，建议马上进行下一步实验，否则请保存于-20±5℃待用(30天内)。

　　12.如果在标本处理中没有控制好交叉污染，可能出现假阳性。

　　13.因实验过程中涉及产物开盖等操作步骤，因此建议定期对实验室内的气溶胶进行检测，避免影响实验结果。

　　【参考文献】

　　1. Avettand-FènoëlV,HocquelouxL,GhosnJ,etal.TotalHIV-1DNA,aMarkerof ViralReservoirDynamicswithClinical Implications. Clin Microbiol Rev, 2016, 29(4):859-880.

　　2. Rouzioux C, Avettand-FenoëlV. Total HIV DNA: a global marker ofHIV persistence. Retrovirology,2018,15(1):30.

　　3.董莉娟, 陈会超, 马艳玲,等. HIV-1 DNA的检测及临床应用 [J]. 中华流行病学杂志,2022,43(10):1685-1690.

　　【基本信息】

　　注册人/生产企业名称：广州达安基因股份有限公司住所：广州市高新技术产业开发区香山路19号

　　联系方式：

　　售后服务单位名称：

　　联系方式：

　　生产地址：广州市高新技术产业开发区香山路19号;

　　广州市高新技术产业开发区荔枝山路6号;

　　广州市黄埔区香山路17号B104号房。

　　生产许可证编号：粤食药监械生产许20040999号

　　【医疗器械注册证编号/产品技术要求编号】

　　【说明书批准日期/生效日期及修改日期】