耶氏肺孢子菌核酸检测试剂非临床性能技术审评要点（征求意见稿）（2026年最新版）

　　本要点旨在指导注册申请人对对耶氏肺孢子菌核酸检测试剂非临床性能注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门提供参考。

　　本审评要点是对耶氏肺孢子菌核酸检测试剂的一般要求，注册申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

　　本审评要点是供注册申请人和技术审评人员使用的指导性文件，但不包括审评审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，应在遵循相关法规的前提下使用本审评要点。如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料。

　　本审评要点是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，相关内容也将适时进行调整。

一、适用范围

　　本审评要点适用于采用实时荧光聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，下文简写为PCR)法，对肺泡灌洗液、痰液样本中耶氏肺孢子菌核酸进行体外定性诊断的试剂。该试剂可用于耶氏肺孢子菌感染的辅助诊断。

　　耶氏肺孢子菌是一种寄生于肺部的机会致病菌，当机体免疫力正常时可长期存在于人体中，可作为病原携带者传播给其他人。当机体免疫力下降时，对免疫功能低下人群，如获得性免疫缺陷综合征(艾滋病)、器官移植、血液恶性肿瘤等人群，肺孢子菌感染机体且大量增殖，从而引起耶氏肺孢子菌肺炎。该病菌可通过空气飞沫传播。

　　本要点的技术要求是基于荧光PCR方法建立的，对于其他分子生物学检测技术，可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行或补充其他的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。

　　对于耶氏肺孢子菌与新型隐球菌、曲霉菌属联合检测的试剂，应结合适用的预期人群、样本类型、临床适应症等，针对联合检测的非临床性能进行充分研究。

　　本审评要点适用于进行产品注册和变更注册申报的产品。本要点针对相关产品注册申报资料中的部分内容进行撰写，其他未尽事宜应当符合相关法规要求。

二、注册审查要点

　　(一)监管信息

　　1.产品名称及分类编码

　　产品名称应符合《体外诊断试剂注册与备案管理办法》及相关法规的要求，如耶氏肺孢子菌核酸检测试剂盒(荧光PCR法)。按照《体外诊断试剂分类规则》和《体外诊断试剂分类目录》，该产品管理类别为Ⅲ类，分类编码为6840。

　　2.注册申请人还需提交产品列表、关联文件、申报前与监管机构的联系情况和沟通记录及符合性声明等文件。

　　(二)综述资料

　　内容应符合《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》的相关要求，主要包括概述、产品描述、预期用途、申报产品上市历史及其他需说明的内容。建议申请人着重介绍以下几方面内容：

　　1.产品描述中应详述检测原理，介绍靶基因的选择及依据，描述特异性引物、探针的设计原则。明确内标与质控的设置和选择依据，如有防污染措施，需描述防污染的原理。

　　2.与同类和/或前代产品的比较，应着重从样本类型、检测的靶基因、分析性能(如准确度、精密度、检出限等)、阳性判断值、临床性能以及临床用途、适用人群等方面详细说明申报产品与目前市场上已获批同类产品之间的异同。

　　(三)非临床资料

　　1.分析性能研究

　　注册申请人应采用在符合质量管理体系的环境下生产的试剂盒进行分析性能研究，提交具体研究方法、试验方案、试验数据、统计分析结果等详细资料。

　　如申报产品适用不同的机型，需要提交采用不同机型进行性能评估的资料。如申报产品包含不同的包装规格，需要对各包装规格进行分析或验证。

　　分析性能评估所用样本的基本信息均需明确，例如样本来源、样本类型、采集和处理方式、稀释方式、定值过程及数据等。

　　分析性能评估用样本一般应为真实样本，如需稀释，应采用阴性样本进行稀释。

　　建议着重对以下分析性能进行研究。

　　1.1样本稳定性

　　样本稳定性研究包括采集的原始样本、经过消化液处理的样本，研究内容包括冷藏保存时间，冷冻保存时间。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。

　　对于样本提取后不能立即进行检测的，应明确核酸储存条件、储存时间等，同时应提供相应的核酸稳定性研究资料。

　　1.2适用的样本类型

　　常用样本类型为支气管肺泡灌洗液或深部诱导的痰液样本。

　　如同时适用于肺泡灌洗液和痰液样本，应采用合理方法评价样本类型的适用性。两种样本类型应分别进行分析性能研究，以及阳性判断值研究。

　　1.3核酸(RNA)提取/纯化性能

　　在进行核酸检测之前，建议有核酸提取/纯化步骤。该步骤的目的除最大量分离出目的RNA外，还应有相应的纯化作用，尽可能去除PCR抑制物。对配合使用的所有核酸提取试剂进行提取核酸纯度、浓度、提取效率的研究，并与质量较好的核酸提取试剂进行平行比对。若产品适用两种或以上核酸提取试剂，则每一种核酸提取试剂均需配合检测试剂进行抗干扰、精密度和检出限的验证。

　　1.4阴阳性符合率

　　采用申报产品与对比方法或临床诊断确定后的不同浓度水平的临床样本进行检测结果的对比，评估申报产品的阴阳性符合率。应包括一定数量不同浓度水平的阳性样本和阴性及干扰样本。

　　如企业参考品中的阴/阳性参考品为样本基质，也可通过验证企业参考品进行阴阳性符合率的研究，提供详细的试验数据。

　　1.5精密度

　　应对精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。应考虑运行、时间、操作者、仪器、试剂批次和地点等影响精密度的条件，设计合理的精密度试验方案进行评价。精密度评价试验应包含核酸提取步骤。设定合理的精密度评价周期，例如为期至少20天的检测。对检测数据进行统计分析，获得重复性、实验室内精密度、实验室间精密度、批间精密度等结果。

　　应至少包含3个水平：阴性样本、弱阳性样本、中/强阳性样本，并根据产品特性设定适当的精密度要求，例如：

　　阴性样本：待测物浓度为零浓度，阴性检出率应为100%(n≥20)。

　　弱阳性样本：待测物浓度略高于试剂盒的检出限，阳性检出率应为100%(n≥20)。

　　中/强阳性样本：待测物浓度呈中度到强阳性，阳性检出率为100%且Ct值的CV≤5%(n≥20)。

　　1.6检出限

　　1.6.1检出限的确定

　　建议采用至少3个样本系列稀释于与适用样本一致的基质中，进行检出限的确定。每个浓度梯度重复检测，记录不同浓度检出的结果，采用适当的模型(如Probit分析)和分析方法，将具有95%阳性检出率的最低浓度水平作为确定的检出限。

　　1.6.2检出限的验证

　　选择另外3个不同来源的样本在检出限浓度水平进行验证，应达到95%阳性检出率。

　　1.7分析特异性

　　1.7.1交叉反应

　　用于耶氏肺孢子菌核酸检测试剂交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下几方面：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他微生物。常见的病原体如：动物源肺孢子菌、新型隐球菌、曲霉菌属、念珠菌属等;肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌;冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒;肺炎支原体、肺炎衣原体等。

　　建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常，细菌感染的水平为106cfu/mL或更高，病毒为105pfu/mL或更高。

　　申请人应提供所有用于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别信息和浓度确认等试验资料。

　　1.7.2干扰物质

　　应根据所采集样本类型，针对可能存在的内源/外源物质干扰情况进行验证。推荐用于干扰研究的物质见表1。建议申请人在每种干扰物质的潜在最大浓度(“最差条件”)条件下进行试验，检测包含检出限水平和阴性水平的样本。对结果进行合理的统计分析，对比添加干扰物质前后的Ct值差异。检测的潜在干扰物包括样本中的原有物质及在样本采集和处理期间引入的物质。

　　表1　推荐用于干扰研究的物质

物质	活性成分
粘蛋白	纯化粘蛋白
血液（人类）
气道局部麻醉药	如利多卡因
抗炎平喘药物	如地塞米松、甲泼尼龙、布地奈德
抗病毒药物	如扎那米韦、利巴韦林、奥司他韦、帕拉米韦、替诺福韦
抗真菌药物	如伊曲康唑（曲霉、念珠菌）、氟康唑（白念、隐球菌）、伏立康措（曲霉、念珠菌）、两性霉素B
解热镇痛药	如对乙酰氨基酚

　　1.8包容性

　　验证至少10例不同来源的临床阳性样本。研究应包括检出限和重复性的验证。

　　应能够提供用于包容性验证的样本的来源、浓度水平确定等信息。验证所用临床样本与最低检测限研究的样本不能重复使用。

　　2.阳性判断值

　　阳性判断值确定资料主要指对耶氏肺孢子菌核酸检测的Ct值进行确认和验证，阳性判断值研究样本来源应尽可能考虑样本来源的多样性、代表性，充分考虑不同年龄、性别、地域等因素。如存在判定值灰区，应提供灰区的确认资料。如采用其他方法对阳性判断值进行确认研究，应说明这种方法的合理性。提供内标值的确定方法和研究资料。

　　3.主要原材料研究资料

　　3.1此类产品的主要原材料包括引物、探针、酶、dNTP、核酸分离/纯化组分(如有)、企业参考品、质控品、内标等。应提供主要原材料的选择与来源、制备过程、质量标准等相关研究资料、质控品的定值试验资料等。

　　阳性质控品建议采用工程菌制备。

　　应明确靶标基因，提供检测靶标的详细确定依据，详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况。

　　3.2企业参考品制备

　　申请人应设定企业参考品，包括阳性参考品、阴性参考品、检出限参考品、精密度参考品。企业参考品可以采用临床样本、基因组提取/纯化物等核酸制备。

　　4.其他

　　其他研究内容，如生产工艺、反应体系、稳定性等研究资料，可参考其他病原体核酸检测试剂指导原则进行研究。