人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）DNA 检测试剂盒 （PCR-荧光探针法）体外诊断试剂产品注册临床前研究概述

　　人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)DNA 检测试剂盒(PCR-荧光探针法)是一种高度敏感和特异的体外诊断试剂，用于定量检测人全血中的 HIV-1 DNA。该试剂盒通过 PCR 技术和荧光探针法，针对 HIV-1 M 组的高度保守区域设计特异性引物和探针，确保了检测的准确性和可靠性。临床前研究包括主要原材料的选择与质量控制、生产工艺及反应体系的优化、分析性能评估(如检出限、线性范围、准确度、精密度、特异性及核酸提取性能)以及阳性判断值和稳定性研究。结果显示，该试剂盒在检测限、线性范围、准确度、精密度和特异性等方面均表现出优异的性能，能够有效排除假阳性和假阴性结果。此外，试剂盒在不同储存条件下的稳定性也得到了验证，确保了其在实际应用中的可靠性和稳定性。这些研究结果为该试剂盒的临床应用提供了坚实的科学基础。

一、产品概述

（一）产品主要组成成分

　　人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)DNA检测试剂盒(PCR-荧光探针法)的主要组成成分如下表所示：

　　备注：不同批号试剂盒中各组份不可以互换或混用。

（二）产品预期用途

　　本试剂盒用于体外定量检测人全血中人类免疫缺陷病毒 I 型(HIV-1)M 组的 DNA。检测结果用于 HIV-1 感染者抗病毒治疗效果的评价。检测结果不作为患者病情评价的唯一指标，必须结合患者临床表现和其他实验室检测对病情进行综合分析。本试剂盒不得用于血源筛查。

（三）产品包装规格

　　48 测试/盒。

（四）产品检验原理

　　本试剂盒针对 M 组 HIV-1 亚型的高度保守区域设计 HIV-1 特异性引物和 HIV-1 特异性探针(Taqman 探针)，配以 PCR 反应液、耐热 DNA 聚合酶(Taq 酶)、核苷酸单体(dNTPs)等成分，用 PCR 体外扩增法定量检测 HIV-1 DNA。

　　本试剂盒设置了内标和细胞定量体系，用于控制假阴性及定量样本中所含细胞或人类基因组数量。本试剂盒设置了 dUTP/UDG 反应体系，PCR 扩增时 37℃预处理，利用 UDG 酶将可能存在的 PCR 产物污染充分降解，排除假阳性结果。

二、临床前研究概述

（一）主要原材料

　　主要原材料的选择

　　本产品的主要原材料包括：引物、探针、Taq酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG酶)、dN(U)TPs、定量参考品和质控品等，这些原材料通过外购和自行制备的方式获得。申请人对主要原材料进行了供应商的选择，通过功能性试验，筛选出合格供应商，制定了主要原材料的技术要求和质量标准并经检验合格。

　　企业参考品和对照品的设置情况

　　本产品的企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、线性参考品、最低检出限参考品及精密度参考品。参考品采用临床标本和细胞制备而成。

　　阳性参考品：12支，包括不同浓度水平的细胞以及不同亚型的 HIV-1 阳性全血样本。

　　阴性参考品：10支，来源于不同的 HIV-1 阴性的人全血样本，包括健康人全血样本及乙型肝炎病毒核酸阳性样本等其他病原体阳性样本。

　　线性参考品及检出限参考品：7支，由 HIV-1 DNA 阴性人类细胞梯度稀释含有待测靶标的细胞制备而成。

　　精密度参考品：2支，包含两个浓度水平，由含有待测靶标的细胞制备而成。

　　本产品设置了 HIV-1 DNA 阴性质控品、HIV-1 DNA 强阳性质控品和 HIV-1 DNA 弱阳性质控品，用于检测过程中试剂盒和仪器的质量控制。

（二）生产工艺及反应体系研究

　　申请人对生产工艺及反应体系的研究包括 HIV-1 引物/探针浓度、细胞(内标)引物/探针浓度、酶用量、反应体系体积、PCR 扩增反应温度和时间、样本用量等分别进行了优化或研究。申请人通过企业内部研究试验，最终确定了最佳的生产工艺和反应体系。

（三）分析性能评估

　　检出限与定量限

　　申请人以梯度稀释的 HIV-1 DNA 单拷贝整合细胞为样本，采用三批试剂对系列浓度样本进行检测，确定该产品检出限为 50 copies/10^6 cells，定量限为 100 copies/10^6 cells。采用 HIV-1 不同亚型临床样本进行检出限与定量限的验证，结果均符合检出限与定量限的性能要求。

　　线性范围

　　申请人采用梯度稀释的 HIV-1 DNA 单拷贝整合细胞为样本和临床样本，样本浓度为 1.0×10^2 copies/10^6 cells～1.0×10^6 copies/10^6 cells，分别使用三批试剂盒进行检测，结果表明产品在 1.0×10^2 copies/10^6 cells～1.0×10^6 copies/10^6 cells 范围内，测量浓度和理论浓度呈线性相关，线性相关系数 r≥0.980。

　　准确度

　　申请人使用 HIV-1 DNA 单拷贝整合细胞和临床阳性样本，分别用 293T 细胞和 HIV-1 阴性全血样本进行系列稀释，制备 1×10^6、1×10^5、1×10^4、1×10^3 和 1×10^2 copies/10^6 cells 五个梯度样本，分别使用三批试剂盒进行检测，结果浓度对数值与理论值浓度对数值的绝对偏差均不超过±0.5，符合准确度的性能要求。

　　精密度

　　申请人使用三批试剂盒在不同适用机型上，对高低浓度的临床阳性全血样本进行重复检测。批内、批间检测结果的检测精密度参考品 CV 均<5%，符合精密度的性能要求。

　　分析特异性

　　在交叉反应研究中，申请人以乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒、巨细胞病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒 II 型、E-B 病毒、人类免疫缺陷病毒 II 型和抗核抗体，以及系统性红斑狼疮、类风湿关节炎患者血清为待测样本，使用三批试剂盒在适用仪器上检测，检测结果均为阴性。

　　在干扰物研究中，采用三批试剂盒，对各种可能的干扰物质进行评价。结果显示血红蛋白(2 g/dL)、总胆红素(28 mg/dL)、甘油三酯(3000 mg/dL)、总 IgG(40 g/L)以及 EDTA 终浓度为(300 mg/dL)对试剂盒的检测结果无影响。相关治疗药物，包括替诺福韦、齐多夫定、恩曲他滨、奈韦拉平等，对检测结果无影响。

　　核酸提取

　　申请人使用 HIV-1 阳性样本，使用海力特公司的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备 20191421)和凯杰公司 QIAamp DNA Blood Mini Kit 的提取试剂盒进行对比研究，结果显示核酸提取或纯化试剂均满足申报产品性能要求。

（四）阳性判断值研究

　　选择已确认的 HIV-1 阳性样本 87 份和 40 份临床 HIV-1 阴性全血样本，采用 ROC 曲线分析，结果显示所有阴性样本结果全部为未检出，所有临床确诊感染样本均检出，最低检测值为 5.8 copies/1×10^6 cells(报告为“检出，< 50 copies/1×10^6 cells”)。结合产品性能评估研究资料确定本试剂盒的检测下限为 50 copies/1×10^6 cells。

（五）稳定性研究

　　申请人对本产品的效期稳定性、开封稳定性、冻融稳定性、运输稳定性以及样本稳定性进行研究，确定了在各种条件下本产品及样本的有效保存时间。

　　效期稳定性：将三批试剂盒储存于 -20±5℃条件下，分别在第 0、2、4、6、7、8、9、10、11、12、13 和 14 个月对试剂盒的外观、阴阳性符合率、最低检出限、定量限、准确度、精密度进行考察，各项性能指标均符合要求。结果表明：产品在 -20±5℃条件下，储存 14 个月后检测性能稳定。

　　开封稳定性：试剂盒开封后在 2-8℃条件下保存，24小时内性能稳定。

　　冻融稳定性：试剂盒在 -20±5℃条件下冻融三次后，性能稳定。

　　运输稳定性：试剂盒在 2-8℃条件下运输，性能稳定。

　　样本稳定性：全血样本在 2-8℃条件下保存 72小时，性能稳定。

三、总结

　　人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)DNA 检测试剂盒(PCR-荧光探针法)是一款高度敏感和特异的体外诊断试剂，用于定量检测人全血中的 HIV-1 DNA。该试剂盒通过优化的 PCR 技术和严格的质控体系，确保了检测结果的准确性和可靠性。临床前研究表明，该试剂盒在检出限、线性范围、准确度、精密度、特异性和稳定性等方面均表现出优异的性能。这些研究结果为该试剂盒在临床应用中的可靠性和有效性提供了有力的支持。未来，该试剂盒将在 HIV-1 感染者的抗病毒治疗效果评价中发挥重要作用，为患者的健康管理提供重要的参考依据。